[发明专利]棉铃虫对Cry1Ac 毒素非隐性抗性钙粘蛋白胞质区缺失突变的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，涉及棉铃虫对Cry1Ac毒素非隐性抗性钙粘蛋白胞质区缺失突变的分子检测方法。 

技术背景

表达Cry1Ac毒素蛋白的转Bt基因棉花，从1997年开始在我国推广应用，目前已大规模种植于黄河流域和长江流域棉区，平均占到全国棉花种植面积的75%左右。由于转基因Bt棉花的大规模推广应用的高强度选择压力导致其靶标害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）对Cry1Ac毒素产生抗性，是Bt棉花使用中面临的最大威胁。目前研究表明棉铃虫中肠肠壁细胞钙粘蛋白基因突变是抗性形成的主要原因。钙粘蛋白是一类对细胞粘结起决定作用的依赖Ca²⁺的糖蛋白，参与多种细胞活动，是由12个重复子的胞外区、跨膜区和较小的胞内区组成。以往发现的基因突变部位均位于钙粘蛋白胞外区结构域，通过转座子的插入或片段缺失导致钙粘蛋白翻译提前终止，丧失了毒素结合区，从而对Cry1Ac产生抗性，这种功能丧失性突变产生的抗性通常呈隐性。 

2009年利用F1单对检测法共检测230头山东夏津田间棉铃虫，检测到携带抗性基因的个体有67头。根据F1检测的原理(Zhang等,Diverse genetic basis of field-evolved resistance to Bt cotton in cotton bollworm from China.PNAS，2012，109(26):10275-10280)，这些抗性个体与室内抗性品系SCD-r1单对杂交(Yang等，Introgression of a disrupted cadherin gene enables susceptible Helicoverpa armigera to obtain resistance to Bacillus thuringiensis toxin Cry1Ac.Bulletin of Entomological Research,200,99(2):175-181)，F₁代经诊断剂量（1μg/cm²Cry1Ac）处理存活个体应含有两个钙粘蛋白等位基因，一个来自SCD-r1品系（r₁）(Yang等，Identification and molecular detection of a deletion mutation responsible for a truncated casherin of Helicoverpa armigera.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2006,36(9):735-740)，另一个来自田间个体（r_x）。SCD-r1品系的抗性是由钙粘蛋白突变基因r₁引起的，r₁缺失大部分胞外区和整个跨膜区及胞质区，因此可以通过4组特异性引物选择性的克隆出田间抗性个体的钙粘蛋白基因r_x（Zhao等，Diverse cadherin mutations conferring resistance to toxin Cry1Ac in Helicoverpa arimgera.,2010,40(2):113-118）。克隆了20个田间抗性个体的钙粘蛋白基因序列，鉴定到1个新的钙粘蛋白突变基因r₁₅。测序结果表明位于钙粘蛋白胞质区的第32号外显子缺失165个碱基，导致其编码的55个氨基酸发生缺失，这种钙粘蛋白胞质区突变能够使Cry1Ac毒力显著降低，从而导致抗性产生。（见附图1、见附图2）。 

多年多点的田间监测表明，虽然棉铃虫对Bt棉花的抗性水平没有明显上升，但田间对Cry1Ac毒素抗性基因频率在逐年增加，特别是新发现的非隐性抗性基因频率增加明显。目前主要的抗性监测技术包括：剂量对数-死亡机率值法（抗性倍数法）、F1检测法、F2检测法、诊断剂量检测法及分子检测法。但前面四种抗性监测方法在棉铃虫对Bt棉花的抗性监测中都有明显的缺点，如不能检测抗性基因类型，难以确定合适的诊断剂量，室内必须有相应抗性品系，成本高，花费时间长等，导致对抗性监测的不准确和延后，严重影响后续有效抗性治理的开展和实施。而分子检测方法可以直接检测抗性基因型，精确性高，对待测样本的状态无要求，对抗性基因显隐性无要求，具有灵活性和稳定性。 

发明内容