[发明专利]一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌菌种

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌菌种。 

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的以仔猪呕吐、严重腹泻和高致死率为特征的消化道传染病。该病是我国及世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。疫苗免疫接种是预防本病的主要措施。实践证明，肠道粘膜免疫所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗TGEV感染的有效抗体，而非经口免疫所产生的其它血清抗体，如IgG、IgM对本病的免疫保护效果并不理想。因此选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统，有效的刺激粘膜免疫系统所产生的粘膜免疫应答对本病的防治具有重要意义。 

然而，现有的疫苗一般需要注射，常规注射疫苗会产生应激及疫苗吸收的问题，而通过口服免疫时，免疫原在到达小肠粘膜之前会存在被降解或灭活的可能，虽然以细菌病毒为活载体可达到这一目的，但细菌病毒对人体会有一定的伤害性，且不能在肠道粘膜定居。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种安全无毒，能在肠道粘膜定居的表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌菌种。 

本发明采用如下技术方案：

它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-S  CCTCC M 2012355；保藏名称：一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌：乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-S；保藏日期2012.9.16。

本发明表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌菌种的有益效果是：可以口服，口服免疫的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能，满足这一要求的必须是活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。以细菌病毒为活载体均可达到这一目的，但作为安全无毒，能在肠道粘膜定居的活载体系统，乳酸乳球菌是最合适的载体系统。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，可经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应。

附图说明

图1为Western blot分析结果图。 

具体实施方式

请参阅图1所示，本发明的一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤： 

1.  总RNA的提取

取已处理的TGEV细胞毒悬液250μl分别加入到无菌无RNA酶的离心管，再加入750μl TRIzol LS Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5分钟。 加入200μl预冷的氯仿（4℃保存），振荡至充分乳化均匀，4℃静置15分钟。于4℃、12000r/min离心15分钟，取出离心管，轻轻吸取上层水相约450μl移入另一离心管。加入等体积冷异丙醇（-20℃保存），颠倒混匀后置-20℃ 30分钟。4℃、12000r/min离心10分钟，取出离心管，弃去上清液，加入1毫升 75％的冷乙醇（-20℃保存），颠倒数次洗涤核酸。于4℃、12000r/min离心5分钟，取出离心管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸，然后用DEPC水20μl溶解，离心管中的溶液就是TGEV的总RNA。

2.  S基因的克隆

根据TGEV S基因5，和3，末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5，端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点。

序列1：5’-cgttgtcgacccatgaaaaaactgttcgttgttctggttgtaat-3’

序列2：5’-agaagcttttaatcgtgcacaccactattatcagacggtacaccc-3’

这对引物（序列1和序列2）被用来进行RT-PCR扩增产生cDNA。取总RNA液8μl，加入1μl 40μ mol/L反向引物（序列2）70~80℃变性5分钟，立即冰浴3分钟。随后依次加入4μl M-MLV 5×RT buffer，5μl 4mmol/L dNTPs，40u Rnasin，200u M-MLV，混合，离心，加入DEPC水使总体系达20μl，离心数秒种后，37℃水浴1小时，95℃10分钟灭活RT酶。