[发明专利]小鼠抗人CD23单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及以原核表达的CD23蛋白免疫小鼠获得的分泌CD23单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E9，属于生物工程技术领域。 

背景技术

CD23也称FcεRII，是人和脊椎动物的IgE低亲和力受体，即IgE的II型受体；它是一种广泛分布于B细胞、嗜酸粒细胞(EOS)、激活的单核/巨噬细胞、血小板、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞(Langhans Cells)、表皮角细胞、胸腺上皮细胞、部分T细胞、自然杀伤细胞等细胞膜表面的跨膜糖蛋白，分子量为45kDa。 

CD23属于典型II型穿膜糖蛋白，由321个氨基酸组成，包括由23个氨基酸残基组成的胞内N-末端、21个氨基酸残基组成的穿膜区及277个氨基酸残基组成的的C-末端膜外区；其羧基末端位于细胞外，氨基末端位于细胞内，属于C型动物凝集素超家族。人CD23基因位于19号染色体上，是单拷贝基因，有两种类型，由于它们的启动基因不同造成所编码的CD23分子氨基末端的6个氨基酸不同，形成了两种CD23：CD23a和CD23b。CD23a主要在B淋巴细胞和嗜酸性细胞中表达，而CD23b在激活的单核/巨噬细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞、表皮角细胞、胸腺上皮细胞、部分T细胞、自然杀伤细胞及某些白血病细胞上都有表达。骨髓腔基质来源的巨噬细胞高表达CD23b。细胞膜表面CD23可由自身或被蛋白水解酶裂解为多种大小不等的可溶性片段，称为可溶性CD23(sCD23)，这些片段大部分仍可与IgE结合，且表现出与IgE无关的多种功能。 

CD23是多功能受体分子/细胞因子，它参与调节IgE的合成、促进B细胞激活、增殖和分化，并通过与膜CD21的结合介导B-T细胞相互作用、增强B细胞向T细胞提呈抗原，促进T细胞成熟。可溶性CD23(sCD23)还可协同IL-1促进胸腺细胞、骨髓前体细胞、生发中心B细胞增殖和分化，抑制单核细胞游走，诱导单核细胞释放TNF-α、IL-1和IL-6。CD23表达于外周血细胞的某些亚群、B淋巴细胞和EB病毒转染的B淋巴瘤细胞系，在慢性淋巴细胞白血病和部分中心母细胞淋巴瘤中也有表达；可能通过促进B细胞活化、分化、成熟、防止生发中心B细胞凋亡，使B细胞出现高反应性、合成和分泌自身抗体、引起自身免疫。可溶性CD23(sCD23)与支气管哮喘关系密切，在细胞间粘附、抗原的呈递、T和B细胞的活化、IgE合成、哮喘相关基因的转录等过程中可能发挥重要作用。 

CD23在免疫系统中有多种功能，在细胞激活与增殖、抗原递呈及IgE合成等方面都发挥着作用，且CD23在免疫调控、信号转导及其与疾病的关系等方面起到的重要作用也 越来越受到关注受。 

目前，国内外已经获得了多种CD23的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的CD23的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测CD23表达的小鼠抗人CD23单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 

(1)根据CD23的基因序列(NM_001207019.2)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增CD23基因，构建重组表达载体PET28a-CD23，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。 

(2)采用经典的细胞融合技术制备CD23单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。 

(3)采用免疫组织化学分析CD23单克隆抗体染色人慢性扁桃体炎石蜡切片。 

(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体CD23重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体CD23的重链和轻链可变区序列。