[发明专利]小鼠抗人P504S单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及以原核表达的P504S蛋白免疫小鼠获得的分泌P504S单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A12，属于生物工程技术领域。 

背景技术

P504S即α-甲基酰基辅酶A消旋酶(alpha-methylacyl-CoA racemase，AMACR)，是一种胞浆蛋白，属于CAIB-BAIF CoA转换酶家族，最初在小鼠肝线粒体中发现，同时存在于人类和小鼠的过氧化物酶和线粒体中。P504S基因定位于染色体5p13，是一个1621-bp的cDNA，编码由382个氨基酸残基构成的蛋白P504S(也叫AMACR)。 

P504S蛋白是存在于线粒体和过氧化物酶体中的一种酶，它参与支链脂肪酸(包括降植烷酸)和胆汁酸的代谢，在支链脂肪酸和其衍生物以及胆汁酸中间代谢产物的β-氧化中起着关键的作用。P504S主要催化α-甲基支链脂酰基辅酶A由R型催化转化为S型，只有S型α-甲基支链脂酰基辅酶A才能通过过氧化物酶体进行代谢，因而P504S在支链脂肪酸和胆汁酸的代谢中发挥着重要作用。 

P504S在前列腺癌组织的mRNA和蛋白水平上均有大量表达，表达水平显著高于正常人。近年来，有研究者运用微生物信息和克隆杂交繁殖技术，克隆出P504S基因，编码P504S(AMACR)蛋白；运用高产量cDNA微阵列分析、Northern blot及定量实时PCR等方法证明了P504S(AMACR)选择性地在前列腺癌中过表达，而在正常及良性增生的前列腺组织中几乎不表达。因此，P504S可作为一种前列腺癌的特异性标记物和早期前列腺癌病变的诊断指标。应用P504S免疫组化染色后，能够容易地辨别出恶性的前列腺癌，从而提高前列腺癌诊断的准确性。 

P504S可以作为前列腺癌诊断的阳性指标，但P504S的高表达也并非仅仅见于前列腺癌。目前的研究发现，P504S主要在前列腺、肾、结肠及直肠癌中有特异性表达。在结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、乳头状肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、淋巴瘤和黑色素瘤等肿瘤中均可见P504S过量表达。 

P504S在临床上是一个应用意义极大的分子。随着人们对肿瘤发生、发展机制研究的不断深入，P504S越来越成为人们关注的焦点。 

制备P504S抗体并将其应用于免疫组化染色，会大大提高诊断前列腺癌的准确度。目前，国内外已经获得了多种P504S的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的P504S的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测P504S表达的小鼠抗人P504S单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 

(1)根据P504S的基因序列(NM_001167595.1)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增P504S基因，构建重组表达载体PET28a-P504S，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。 

(2)采用经典的细胞融合技术制备P504S单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。 

(3)通过免疫组织化学分析P504S单克隆抗体染色人前列腺癌石蜡切片。 

(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体P504S重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体P504S的重链和轻链可变区序列。 

本发明提供的以原核表达的P504S蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌P504S单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为4A12，分类命名为小鼠抗人P504S杂交瘤细胞系，该细胞株4A12已于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.6857。 

本发明还提供了所述杂交瘤细胞株4A12，CGMCC No.6857产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：10。