[发明专利]一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶（β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase;EC 1.1.2.3.4，简称GOD），是一种富含糖基的黄体蛋白，它能够在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。

葡萄糖氧化酶(GOD)是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。

在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。

在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成过氧化氢，还可用于对过氧化氢敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。

GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。

GOD广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源。从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉（具有GRAS资格）和青霉属菌株作为GOD生产菌。

产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素。葡萄糖氧化酶大规模生产广泛采用黑曲霉或青霉发酵，但青霉和黑曲霉发酵产生过氧化氢酶，纤维素酶，淀粉酶等其他多种副产物，大量的杂蛋白对后期的分离纯化工作造成很大的困难，也增加了生产成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，以一种产葡萄糖氧化酶的基因工程菌为生产菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 2012266，于2012年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心；其特征在于将活化后YPD扩培的菌液接入全自动发酵罐中的发酵培养基进行发酵处理，接种量为10%，以25%氨水控制pH 5.5，温度30℃，调节搅拌转速和通气量维持溶氧30%以上；当甘油耗尽DO迅速上升时，开始流加50%甘油补料生长培养基，当菌体干重达到100g/L后，停止补料；待甘油再次耗尽，继续保持基质匮乏状态约1h后，开始流加诱导培养基，诱导条件为：温度降低至20-25℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:1-5:1（W/W），并且维持整个诱导过程的甲醇浓度为1.5-2.5%(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

诱导条件优选：温度降低至22℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:1（W/W），并且维持整个诱导过程的甲醇浓度为1.8%(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

所述发酵培养基组成为（1L）：85%磷酸26.7mL/L,CaSO₄ 0.93g/L,K₂SO₄ 18.2g/L,MgSO₄·7H₂O 14.9g/L,KOH 4.13g/L,甘油40.0g/L,PTM₁ 4.35mL/L,25%氨水调pH 5.5；其中PTM₁（1L）组成为：CuSO₄,6.0g;KI,0.08g;MnSO₄,3.0g;Na₂MoO₄,0.2g;H₃BO₃,0.02g;CoCl₂,0.5g;ZnCl₂,20.0g;FeSO₄·7H₂O,65.0g;biotin,0.2g;and 98%(w/w)H₂SO₄,5mL。

所述补料生长培养基：50%(W/V)甘油，其中含12mL/L PTM₁。