[发明专利]一种检测中外不同牛群体的基因诊断方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性的检测，特别涉及一种检测中外不同牛群体的基因诊断方法。

背景技术

遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个位点在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记大致经历了形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记四个发展阶段。1974年，Grodzicker等首次提出用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）作为遗传标记，开创了直接用DNA作为遗传标记的先河，从而揭开了分子标记研究的序幕。经过数十年的发展，尤其是1985年Mullis等[27]发明了PCR技术以后，分子标记研究呈现出“百家争鸣”的景象。分子标记之所以能反映DNA水平的遗传变异情况主要是基于被研究的DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复机制而产生多态性。经过大量的研究发现，DNA分子标记有许多特点，如直接以DNA的形式表现；某些标记表现共显性；标记数量多；表现为中性；多态性高等。如今，分子标记在生命科学研究领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。

单核苷酸多态性(sinTle nucleotide polymorphism，SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander（1996）提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/T）的变化而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，基因编码区内的SNPs（cSNPs）比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。

标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点（QTL），使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质（酶）标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。分子育种，即分子标记辅助选择（molecularmark-assist selection,MAS），该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在畜禽育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。

Gli3基因属于GLI-Kruppel基因家族中的一员。其参与的Shh信号通路在动物生长发育，尤其是骨骼，神经系统及肢体的发育过程中有重要作用。

本研究采用PCR-SSCP和DNA测序技术，检测了3个中国地方黄牛群体（南阳牛：187头；秦川牛：287头；郏县红牛：139头）和1个国外品种（荷斯坦牛：95头）共708个个体的Gli3基因的遗传变异，分析了其遗传结构和遗传多样性，为中国黄牛的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保存与利用提供遗传学依据。