[发明专利]集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

2.权利要求1所述集胞藻高效双同源重组载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）PCR扩增集胞藻PCC 6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段作为psbA2启动子基因片段、Genbank登录号为X13547.1的集胞藻PCC 6803的psbA2ORF基因片段、Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌终止子T1T2基因片段、Genbank登录号为D13780.1的集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸脱氢酶基因片段和Genbank登录号为L11421.1的集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段；

（2）将步骤（1）获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤（1）制得的集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸脱氢酶基因片段和集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta 6；

（3）将步骤（1）制得的大肠杆菌终止子T1T2基因片段用PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接，得到质粒pBluescript SK T1T2；

然后将步骤（1）制得的psbA2ORF基因片段用SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescript SK T1T2连接，得到质粒pBluescript SK T1T2-downstream；

对质粒pBluescript SK T1T2-downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescript SK T1T2-downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接，得到质粒pBluescript SK T1T2-npt-downstream；

（4）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+Delta15，或者，基因片段Promotor+Delta15和基因片段Promotor+Delta6插入步骤（3）制得的质粒pBluescript SKT1T2-npt-downstream中，制得重组载体；

（5）将步骤（4）制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻；

（6）将步骤（5）制得的转基因集胞藻在20～30℃条件下通气培养8～12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为：

Promotor-F:5’-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’；

Promotor-R：5’-CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’；

扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存。

4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA2ORF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为：

psbA2-F：5’-CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’；

psbA2-R：5’-AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’；

扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。

5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸脱氢酶基因的引物为：

Sy15-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’；

Sy15-R：5’-CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’；

扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。