[发明专利]简套式荧光RT-PCR法检测SFTSV用的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的测试盒。

背景技术

2009年中国疾病预防控制控中心专家在河南省提供的一份患者血液标本中分离到一株新型布尼亚病毒。2010年，中国疾病预防控制控中心通过对多省出现的不明原因发热伴血小板减少综合征（SFTS）病例的监测，通过序列非依赖核酸扩增技术从患者血清中同时发现新型布尼亚病毒基因序列，经对新型布尼亚病毒全基因组信息的解析并结合电子显微镜形态学分析，确定为该新型布尼亚病毒为布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（Sever fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV）。流行病学调查发现，从事野外作业人群易被病毒感染，潜伏期7-9天，始于3月，高峰期在5-7月，可以延续至11月份。主要临床表现为突然起病、发热、乏力、纳差、恶心、呕吐等，部份有头痛、肌肉酸痛、腹泻等症状病情严重者会出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭弥漫性血管内凝血（DIC）等多脏器衰竭死亡，死亡率约12%，SFTS疑似患者血清阳性检出率在70%左右。对于因SFTSV感染引起的SFTS，目前没有有效的疫苗可供使用也无特异性治疗手段，主要为对症支持疗法，因此快速、敏感、特异的检测诊断尤为重要。

人类在传染病控制中，诊断、治疗和预防是三个关键环节，其中及时正确诊断最为关键，是有效治疗的基础也是制定正确预防策略的依据。

目前用于新型布尼亚病毒RNA的检测方法主要有荧光RT-PCR，荧光RT-PCR是20世纪90年代未发展起来的一种检测方法，与常规RT-PCR、ELISA等检测方法相比具有操作简单、实时快速、定性定量、特异敏感、重复性好、不易污染、高通量等优点，是目前各种病毒检测诊断的主流方法。虽然荧光RT-PCR具有上述优点，但针对发热伴血小板减少综合征病人血清中新型布尼亚病毒的检测敏感性不甚理想。如在2012年中国舟山市发现的由新型布尼亚病毒引起的SFTS病人为20例，多数病人血清中病毒载量偏低，荧光RT-PCR方法易造成漏诊，病人入院后首份血清荧光RT-PCR检测结果，Ct值＜30的占20.0%、Ct值在30—35的占40.0%、Ct值＞35的占40.0%。荧光RT-PCR检测方法的阳性判定阈值一般设置在Ct值＜35左右，对于Ct值＞35的样本需重新检测或判为阴性，由此造成的不能及时诊断或漏诊现象给临床治疗与疾病控制带来较大的困难，因此建立比荧光RT-PCR更为敏感的方法势在必行。

另一种可以用于新型布尼亚病毒RNA的检测的方法是套式RT-PCR，套式RT-PCR方法具有高度敏感、高度特异的优点。套式PCR技术是上世纪80年代发展起来的，多用于普通检测方法难以检查到的浓度极低的范本（一个或数个拷贝），能大大增加扩增的效率和忠实性，对样品中微量靶基因的扩增非常有效，十分有利于发热伴血小板减少征病人急性期血清与蜱虫、啮齿类动物等传播媒介体内新型布尼亚病毒微量模板的扩增，但套式RT-PCR方法存在结果判断需要电泳、操作相对繁琐、检测时间长（8小时左右）、容易污染等缺点。

发明内容

针对上述不足，本发明所要解决的技术问题是如何适应集上述荧光RT-PCR和套式RT-PCR两种方法优点并去除其缺点而提出的简套式荧光RT-PCR的要求，以使对SFTSV的检测具有高度敏感特异、不易污染、操作简单、实时快速、重复性好等优点，设计出一套简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒。

本发明提供的简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒，其中包含有两种外引物和两种内引物和一种探针，其中两种外引物的DNA序列分别为：

外引物一P1：5’-agt tca cag cag cat gga gag gat -3’

外引物二P2：5’-agg ttg atg gca ctc cag gag aaa -3’

两种内引物的DNA序列分别为：

内引物一P3：5’- agt tca cag cag cat gga gag gat -3’

内引物二P4：5’- act ctc tgt ggc aag atg cct tca -3’

探针的DNA序列为：5’-FAM-ttg ctg gct ccg cgc atc ttc aca tt-TAMRA -3’。

使用本发明简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：