[发明专利]人工猪表皮生长因子真核表达载体及其制备方法和其酿酒酵母工程菌无效
| 申请号： | 201210531700.4 | 申请日： | 2012-12-11 |
| 公开（公告）号： | CN103014010A | 公开（公告）日： | 2013-04-03 |
| 发明（设计）人： | 郭春华;张兴友;陈友慷;周琳 | 申请（专利权）人： | 深圳比利美英伟营养饲料有限公司;郭春华 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;C12N15/66;C12R1/865 |
| 代理公司： | 广州科粤专利商标代理有限公司 44001 | 代理人： | 刘明星 |
| 地址： | 518103 广东省深圳市宝*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 人工 表皮 生长因子 表达 载体 及其 制备 方法 酿酒 酵母 工程 | ||
1.一种人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MFα-(S)pEGF，其特征在于，在酿酒酵母信号肽Mfα核苷酸序列的3’端接上权利要求1所述的人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，然后将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2.0中，所述的酿酒酵母信号肽Mfα核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MFα-(S)pEGF，其特征在于，所述的将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2.0中是将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2.0的酶切位点Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ之间，用插入片段替换酶切位点Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ之间的核苷酸序列。
4.一种含有权利要求2或3所述的人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MFα-(S)pEGF的酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSc 1。
5.一种权利要求2所述的人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MFα-(S)pEGF的构建方法，其特征在于，首先在酿酒酵母信号肽Mfα的核苷酸序列的3’端接上权利要求1所述的人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，然后将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2.0中，所述的酿酒酵母信号肽Mfα的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2.0中是将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2.0的酶切位点Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ之间，用插入片段替换酶切位点Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ之间的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，其具体构建方法为：
a.将如SEQ ID NO.1所示的人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因的核苷酸序列插入pMD18-T Simple Vector的BamH I酶切位点和Xba Ⅰ酶切位点之间，其5’端接BamHI酶切位点，3’端接Xba Ⅰ酶切位点，由此得到质粒pMD18-T-(S)pEGF；
b.将如SEQ ID NO.2所示的酿酒酵母信号肽MFα的核苷酸序列连接到质粒pMD18-TSimple Vector上，构建成重组质粒pMD18-T-MFα；
c.将重组质粒pMD18-T-Mfα和酿酒酵母表达质粒pYES2.0用内切酶Kpn Ⅰ和内切酶BamH Ⅰ分别对其进行双酶切，然后用T4DNA连接酶将酿酒酵母信号肽MFα的核苷酸序列与酿酒酵母表达质粒pYES2.0连接构建成重组质粒pYES2-Mfα；
d.用内切酶BamH Ⅰ和内切酶Xba Ⅰ分别对重组质粒pYES2-Mfα和质粒pMD18-T-(S)pEGF进行双酶切，然后用T4DNA连接酶将人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因插入重组质粒pYES2-Mfα中构建成人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MFα-(S)pEGF。
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