[发明专利]壬基酚人工抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，更具体涉及一种壬基酚人工抗原的合成方法,本发明利用琥珀酸酐法，将壬基酚上面的羟基进行衍生化，以引进能够与蛋白反应的功能团。利用改进的碳二亚胺法将衍生物NP-HS与蛋白载体反应，合成相应的人工抗原，为壬基酚抗体制备提供技术支持。

背景技术

壬基酚（Nonylophenol，NP），是一种重要的精细化工原料和中间体，主要用于生产表面活性剂、也用于抗氧化剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂等领域，由于NP高度疏水性及化学性质稳定，因此容易在环境中富集而广泛分布，同时通过食物链对水生生物、动物及人类造成危害。有专家表明，NP具有雌激素效应，可导致动物生殖系统的损害，同时对雄性动物的生殖功能也有影响，并对其血清中睾丸酮水平和某些生化指标产生影响。

为了确保人类安全与健康，建立快速、准确监测壬基酚等有害物质的残留是十分必要的。传统的残留分析方法包括气相色谱法、液相色谱法、质谱、薄层层析等，这些方法往往需要很复杂昂贵的仪器，而且需要经过繁琐的前处理，很难达到快速、简便的现场检测要求。而免疫检测分析方法由于具有特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，近年来备受人们的关注。因此，建立起NP的免疫快速检测方法，对于实践中批量化测定样品中NP残留意义重大。本试验制备成功的人工抗原以及由此制备的高效价抗体，可为建立快速检测NP残留的免疫试剂盒提供可靠保证。

壬基酚是小分子化合物，本身不具备免疫原性，不能直接刺激机体产生抗体，必须与连接到大分子载体上以形成较为理想的免疫原。在本实验中，用改进的碳二亚胺法合成壬基酚人工抗原NP-BSA,并对其进行鉴定。然后以此人工抗原免疫balb/c小鼠，制备单克隆抗体，对NP的ELISA检测方法进行研究。为下一步研制壬基酚残留检测试剂盒建立很好的技术平台。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种壬基酚人工抗原的制备方法，该方法合成步骤简单易操作，副反应少，目标物纯度高。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种壬基酚人工抗原的制备方法，其步骤是：

(1)按摩尔比1:1.3称取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反应瓶中，加入DMSO作为溶剂，90℃反应1h后冷却至室温(20-25℃,以下相同)。将冷却的反应液缓慢的加入到超纯水中，边滴加边搅拌，溶液瞬间变成乳白色，上面浮着一层淡黄色的油状物，将上述物质进行抽滤沉淀，用冰超纯水洗涤后抽干，50℃烘干后重结晶3次，干燥得到的淡黄色油状物即为NP-HS。

(2)按摩尔比30：30：1称取N-羟基琥珀酰亚胺：水溶性碳二亚胺：牛血清白蛋白共溶于0.01mol/1PBS中，4℃下搅拌反应过夜。将上述溶液离心（5000r/min，10min），所得上清液为A液；按摩尔比30:6.5的比例称取NP-HS溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液枪取1/2体积的上清液A，以边滴加边搅拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反应3-5h。将反应后的溶液离心（5000r/min，10min），上清液为B，取上清液B，以PBS（pH=7.4）溶液做透析液，置4℃透析3天，每7-9h换一次透析液，除去未反应的DMF、CDC、NHS、NP等小分子物质。将透析好的反应液用棕色玻璃小瓶分装后置于-40℃冰箱中冷冻过夜，然后转移到冷冻干燥机中进行干燥，获得一种壬基酚人工抗原,于-20℃冰箱保存。

人工抗原的鉴定：先根据SDS-PAGE结果测定BSA及NP-BSA的分子量，再采用紫外扫描仪测定得到的壬基酚－牛血清白蛋白的偶联比，分别在279ｎｍ、278ｎｍ波长处测定吸光度值，并计算偶联比。

本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:

壬基酚的物理化学性质决定了在人工抗原的合成过程中可利用的活性基团仅有羟基，对此我们设计了对-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、碳二亚胺法、活泼酯法、琥珀酸酐法五种不同的人工抗原合成方法和技术方案，经紫外扫描图分析对-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、活泼酯法都没有合成目标物，仅碳二亚胺法和琥珀酸酐法合成了目标物，但是碳二亚胺法合成的目标物太少、得率较低。最后经比较分析后确定琥珀酸酐法最优，该方法合成步骤简单易操作，副反应少，目标物得率高、纯度高，所获得的抗血清效价高。

附图说明

图1为一种SDS-PAGE实验结果示意图。

电泳结果显示新合成的NP-BSA与BSA相比其相对迁移率发生了改变。

图2为一种BSA(1g/L)紫外扫描示意图。