[发明专利]一种检测朊病毒蛋白(PrPSC)的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种检测朊病毒蛋白(PrP^SC)的方法，包括以下步骤：

步骤一：将待测样本经10μM蛋白酶K消化，使样本中正常的PrP被水解，而PrP^SC因其蛋白酶抗性不被水解，以消除正常PrP的影响；

步骤二：将步骤一处理后的待测样本流经饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂，利用重组G5P蛋白捕获待测样本中的朊病毒蛋白(PrP^SC)，所述的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白是由序列表中序列1基因编码表达的；

步骤三：用洗脱缓冲液对经过步骤二后的饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂进行洗脱，收集洗脱液，所述的洗脱缓冲液体系的组成及浓度为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，该洗脱缓冲液的pH为7.0；

步骤四：用以下方法检测步骤三收集到的洗脱液中的朊病毒蛋白(PrP^SC)：

(a)洗脱的PrP^SC的为不溶性蛋白，量多则可见白色沉淀；或

(b)洗脱后凝胶电泳经考马斯亮蓝染色出现明显条带即为PrP^SC；或

(c)利用PrP^SC单克隆抗体进行PrP^SC的Western blot检测。

2.一种用于检测朊病毒蛋白(PrP^SC)的试剂盒，包括：

(a)朊病毒蛋白(PrP^SC)的富集洗脱体系：即饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂和洗脱缓冲液，所述的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白是由序列表中序列1基因编码表达的；所述的洗脱缓冲液体系的组成及浓度为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，该洗脱缓冲液的pH为7.0；

(b)蛋白酶K，用于样本处理；

(c)PrP^SC单克隆抗体，用于洗脱的朊病毒蛋白(PrP^SC)免疫印迹检测；

(d)说明书。

3.一种重组表达载体，其特征在于它与序列表中序列1所示的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的编码基因形成重组子可融合表达其所含的His-Tag标签，该载体为pET-28a(+)质粒。

4.一种能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的克隆表达方法，包括以下步骤：

步骤1、G5P重组子的构建：

(1)参照GeneBank(Accession No.J02450)上G5P氨基酸序列对应的基因序列，根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏爱性设计出序列表中序列1所示的重组G5P蛋白表达基因；

(2)通过DNASTAR比对，用引物设计软件设计合成序列表中序列1所示基因的8段引物，并在两端引入同pET-28a(+)质粒一样含有的EcoR I和Xho I酶切位点，以便酶切连接。8段引物如下：

Pr1:CGGAATTCATGATTAAAGTTGAAATT

Pr2:GAAACACCAGAACGGGTGGTGAACTGCGCCTGAGACGGTTTAATTTCAACTTTAATCAT

Pr3:CACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAACCGTATTCAGTGAATGAGCAGCTGTGTT

Pr4:AATCTTGACCAGCACCGGATACTGATTACCCAGATCAACGTAACACAGCTGCTCATTCA

Pr5:CCGGTGCTGGTCAAGATTACCCTGGATGAAGGTCAGCCGGCCTATGCGCCGGGTCTGTA

Pr6:AACCGAACTGACCAACTTTGAACGAGGACAGATGAACGGTGTACAGACCCGGCGCATAG

Pr7:AAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTGATGATTGATCGTCTGCGCCTGGTTCCGGCGAAATAA

Pr8:ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG

其中Pr1的划线部分是EcoR I酶切位点，Pr8的划线部分是Xho I酶切位点。

(3)利用重叠延伸PCR合成目的基因序列，并PCR扩增目的基因；

重叠延伸PCR反应体系：

PCR扩增目的基因的条件：

(4)分别用Xho I和EcoR I于37℃水浴双酶切目的基因和质粒pET-28a(+)-c(+)4h，各自回收后，将两者用T4DNA连接酶于16℃连接反应10h，得到重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P，琼脂糖凝胶电泳鉴定；

步骤2、G5P重组子的表达：

(1)将重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；

(2)取少量上述菌液按1：100比例转接到新鲜LB液体培养基中，于37℃、200r/min摇床培养至OD600=0.6~0.8；

(3)加入一定量的IPTG(0.2-1.2mM)诱导2-12h；

(4)将诱导后的菌液冰浴30min，8000rpm离心20min，4℃，弃上清；

(5)裂解液(NaH₂PO₄20mmol/L，NaCl 0.5mol/L，1%TritonX-100，pH7.4)重悬细菌沉淀，超声波破碎，4℃，12000rpm离心20min，收集上清液；

(6)加入终浓度为5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min，消除核酸干扰，收集上清，利用重组G5P蛋白融合表达的His标签与Ni⁺-NTA树脂形成稳定的亲和偶联特性，使用Ni⁺-NTA琼脂糖层析柱纯化上清液中相对分子质量为9.5KD的重组G5P蛋白，并SDS-PAGE分析鉴定。