[发明专利]一种利用卡那霉素快速筛选菊花转基因植株的方法

权利要求书

1.一种利用卡那霉素快速筛选菊花转基因植株的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）确定菊花叶盘不定芽分化Kan筛选浓度、菊花茎段生根Kan筛选浓度以及Kan溶液浸泡筛选浓度和观察时间：

菊花叶盘不定芽分化Kan筛选浓度的确定：将非转基因菊花叶盘接种到含有不同浓度的Kan的再生培养基上，找到一个刚好能100%抑制菊花叶盘不定芽分化的Kan临界浓度，即为菊花叶盘不定芽分化Kan筛选浓度；

菊花茎段生根Kan筛选浓度的确定：将非转基因菊花带顶芽茎段接种到含有不同浓度的Kan的生根培养基上，找到一个刚好能100%抑制菊花茎段生根的Kan临界浓度，即为菊花茎段生根Kan筛选浓度；

Kan溶液浸泡筛选浓度和观察时间的确定：取长势一致的非转基因菊花的第三片全展叶，洗净后置于盛有少量不同浓度Kan溶液的培养皿中，加入溶液量以刚好浸没叶片为准，根据叶片受害情况确定Kan筛选浓度和观察时间；

（2）采用步骤（1）所确定的菊花叶盘不定芽分化Kan筛选浓度、菊花茎段生根Kan筛选浓度对菊花转化植株进行分化再生阶段和生根阶段的筛选得到生根株系；然后再采用步骤（1）确定的Kan溶液浸泡筛选浓度和观察时间将所述的生根株系经Kan溶液浸泡筛选后得到转基因菊花Kan抗性株系；

（3）转基因菊花的PCR验证：根据转基因载体中的35S启动子序列设计引物对步骤（2）筛选的转基因菊花Kan抗性株系进行PCR 扩增，验证载体片段是否插入菊花基因组。

2.根据权利要求1所述的利用卡那霉素筛选菊花转基因植株的方法，其特征在于步骤（1）中所述的再生培养基为：MS培养基 + 6-BA 1.0 mg·L^-1 + NAA 0.5 mg·L^-1，所述的生根培养基为：1/2 MS培养基，即MS培养基中的大量元素减半，其他成分不变。

3.根据权利要求1所述的利用卡那霉素筛选菊花转基因植株的方法，其特征在于步骤（1）中所述确定Kan溶液浸泡筛选浓度和观察时间的方法为根据菊花叶片的受害程度，把菊花叶片对Kan处理后的最终反应程度划分为4个等级：Ⅰ级：叶色正常，受害病斑未出现；Ⅱ级：叶色轻微变黄，受害病斑占叶面积0～5%；Ⅲ级：叶色变黄，受害明显，与正常叶片差异明显，受害病斑占叶面积5%～10%；Ⅳ级：叶片失绿，褐色病斑大面积出现，受害病斑占叶面积10%以上；菊花叶片刚好出现明显受害症状即Ⅲ级反应的处理浓度为临界筛选浓度，叶片受害级数基本不变的处理时间为观察时间。

4.根据权利要求1所述的利用卡那霉素筛选菊花转基因植株的方法，其特征在于步骤（3）中所述根据转基因载体中的35S启动子序列设计引物的序列为：

35S-F：5’- AGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGG-3’；

35S-R：5’- TTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAG-3’。