[发明专利]高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株

权利要求书

1.高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株按以下步骤制备：

一、设计瘦素转基因序列，基因序列如SEQ ID NO：1所示； 

二、合成瘦素转基因DNA片段Obese’，再导入T载体中；

三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoRⅠ双酶切消化T载体，反应体系为

酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段Obese’；

四、质粒载体双酶切：用BamHI和EcoRⅠ双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C，反应体系为

酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用0.6%琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcDNA3.1/V5-His-C；

五、插入片段Obese’与经过双酶切的载体pcDNA3.1/V5-His-C连接，连接反应体系为

连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’； 

六、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’与质粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000 Reagent共转染CHO-dhfr^-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含HT和NAA、含G418  0.75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经 ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞克隆进行扩大培养；

七、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10^-8 mmol/L、1×10^-7 mmol/L和5×10^-7 mmol/L，最终得到能够在5×10^-7 mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。