[发明专利]稳定高效表达EB病毒Rta蛋白的CHO细胞株、其建立方法、应用以及由其建立的细胞库

权利要求书

1.高效稳定表达EB病毒Rta蛋白的重组CHO细胞株CHO/RTA，其保藏编号为：CGMCC6955。

2.根据权利要求1所述的重组CHO细胞株CHO/RTA，其特征在于，利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞（CHO/dhfr-）作为宿主细胞，经筛选扩增后得到稳定、高效表达EB病毒Rta蛋白的细胞株。

3.根据权利要求2任一所述的重组CHO细胞株CHO/RTA，其表达载体为能与所述DNA片段重组，形成适宜的表达质粒的生物载体。

4.根据权利要求3所述的重组CHO细胞株CHO/RTA，所述表达载体为真核细胞外源基因表达系统。

5.权利要求1～4任一所述CHO细胞株在实际生产中表达EB病毒Rta蛋白的CHO细胞库的应用。

6.权利要求1～4任一所述的CHO细胞株的构建方法，包括如下步骤：

（1）将EBV基因组进行RT-PCR扩增，得BRLF1全长序列cDNA；将BRLF1全长序列cDNA克隆到真核表达载体pCDNA3.1（+）中，构建哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1（+）-EBV-Rta；

（2）用阳离子质脂体Lipofectamine2000将pCDNA3.1（+）—EBV-Rta和pSV2-dhfr共转染CHO/dhfr^-；

（3）用G418和次黄嘌呤、胸腺嘧啶、甘氨酸的选择培养基筛选整合EBV BRLF1和dhfr基因的稳定转染细胞株；

（4）逐步递增氨甲基喋呤浓度的方式，扩增目的基因的拷贝数；

（5）用WesternBlot检测重组CHO细胞培养基中的EBV-Rta；

（6）通过有限稀释法从混合克隆中分离到单克隆，利用ELISA法检测单克隆培养基中EBV-Rta的表达量，筛选到高效表达EBV-Rta的细胞株CHO/RTA。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述EBV基因组为用TAP刺激过的B95-8细胞株（ATCC Number:CRL-10624^TM）内感染所得。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述G418的浓度为0.1～1.0mg/ml；所述次黄嘌呤的浓度为0.01～0.2mmol/L；所述胸腺嘧啶的浓度为0.001～0.03mmol/L，所述甘氨酸的浓度为10～50mg/L。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述氨甲基喋呤的浓度为0.01～1000μmol/L。

10.一种用于表达EB病毒Rta蛋白的CHO细胞库，其特征在于，由权利要求1～4任一所述重组CHO/RTA细胞株建立而成。