[发明专利]一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT

权利要求书

1.一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，碱基序列见如SEQ No.1所示。

2. 权利要求1所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT制备方法，包括以下步骤：

将扩增的PCR产物与载体pMD19-T Simple的连接；连接产物pMD19/HPT转化E.coliDH5α感受态细胞；

质粒的提取、酶切及回收用于转化酵母的线性DNA片段：

利用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒提取过程按照试剂盒说明进行；用XhoI酶切pMD19/HPT质粒；37℃酶切4 h后，加入2.0 μL10×loading buffer终止反应，并用0.8%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段；

转化与筛选

（1）取80.0 μL的K. marxianus感受态细胞，加入浓缩并除盐的线性DNA片段后混匀，转至0.2 cm冰预冷的电击杯中；通过电击的方法把线性DNA片段转化到K. marxianus感受态细胞；

（2）分别取10、25、50、100和200 μL混合液涂布在含有100.0 μg/mL潮霉素和0.1% X-gal（w/v）的YPD平板上；

（3）经过培养挑取长出的蓝色菌落接到含有100.0 μg/mL潮霉素、0.1% X-gal（w/v）的YPD平板上进行纯化；

（4）挑取纯化后的菌落接种于100.0 mL乳糖培养基中，于28 oC、180 rpm振荡培养48 h，测定乳糖酶活性，同时用没有转化的原始菌株作为对照，筛选出乳糖酶产量明显提高的敲除菌株。

3. 制备权利1所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT，所涉及的引物序列如下：

H1  5’-CTCGAGCCATAAGCATCCGAAGAATAGAAAAGTCGA-3’

H2  5’-GTGAGTTCAGGCTTTTTCATACCTATTCTATACTCGTCGTCG-3’ 

H3  5’-GAGTATAGAATAGGTATGAAAAAGCCTGAA-3’

H4 5’-GTAGCTGCAGTCAGTGCTTCAGTGTTCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGC-3’H5 5’-GCACTCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAACACTGAAGCACTGACTGCAGCTAC-3’

H6  5-‘CTCGAGACTAGTAATTATGTCCAGTAAGTAGGTTGTG-3’

YH1 5‘-AACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGC-3’

YH2 5‘-ACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTC-3’

MS  5‘-ATGTCATCAGAGGTAGTGCCTTTG-3’

MX  5‘-TCAATGCTGCTCCCGGGGTAAGAT-3’。