[发明专利]产β-苯乙醇的酿酒酵母工程菌构建、菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产β-苯乙醇的酿酒酵母工程菌构建、菌株及其应用，属于生物工程、食用香料制造技术领域，制备的天然β-苯乙醇香料可用于多种食用香精调配，广泛应用于食品、医药、日化等行业。 

背景技术

β-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)又称2-苯乙醇，是一种具有淡雅、细腻而持久玫瑰香气的芳香醇，微量添加就具有明显增香效果，是使用量仅次于香兰素的第二大香料，可用于调配玫瑰、丁香、橙花、依兰、铃兰等多种果香型香精、酒用香精，广泛应用于食品、医药、日化用品、化妆品和烟草等行业。2-PE还具有镇定提神、杀菌、催情壮阳等作用。 

β-苯乙醇天然存在于多种植物和花精炼油中，如玫瑰、茉莉、水仙、百合等，但多数情况下浓度很低，如玫瑰鲜花中2-PE含量相对较高，一般每吨玫瑰鲜花只能萃取1kg玫瑰精油(2-PE含量约60％)。因而天然2-PE难于规模化生产，无法满足市场需求。目前β-苯乙醇主要采用苯-环氧乙烷法、氧化苯乙烯加氢法等化学合成法生产。化学合成过程中环境污染大，产品常含有难以去除的联二苯、一氯代乙苯、氯乙醇等副产物，影响其产品质量，难以达到食用和日用香料的质量标准。随着人们对“绿色”、“天然”的时尚追求，迫切需要开发新技术以规模化生产天然β-苯乙醇。 

研究表明，多种酵母菌具有合成β-苯乙醇的能力，如酿酒酵母(Saccharomyces cererisiae)、克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus、K.lactis)、毕赤酵母(Pichia fermentans)、球拟酵母(Torulopsis utilis)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)等。但不同种属、菌株之间2-PE的合成能力存在较大差异，选育高产2-PE菌株成为生物转化生产的首要条件。 

关于β-苯乙醇的S.cerevisiae合成途径、调控酶及其基因已有一些研究。以L-苯丙氨酸(L-Phe)为前体，S.cererisiae经Ehrlich途径转化生成2-PE，这是目前生物转化2-PE的快捷、主要途径，2-PE合成代谢受到转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶等关键酶的调节；Ehrlich的第一步转氨反应主要由芳香族氨基转氨酶I(aro8p)参与，由ARO8基因编码，该ARO8基因编码一条950个残基组成的多肽链，其N末端是与DNA结合的区域，C末端富含天冬氨酸，大量负电荷构成多个绕线式α-螺旋，此区域介导蛋白质间的相互作用，并赋予此蛋白激活转录的能力。苯丙酮酸脱羧酶(Aro10p)是Ehrlich途径中另一种关键酶，S.cererisiae的苯丙酮酸脱羧酶由ARO10基因编码，ARO10基因基因的上游调节序列有一个36bp的上游激活序列，并受aro8p 诱导调控。因此认为转氨反应、脱羧反应是S.cerevisiae利用L-苯丙氨酸合成代谢β-苯乙醇的2个关键步骤，分别由芳香族氨基转氨酶(aro8p)、苯丙酮酸脱羧酶(Aro10)所调节。增强S.cerevisiae氨基转移酶基因(ARO8)、脱羧酶基因(ARO10)的拷贝与表达，有利于增强目的产物β-苯乙醇的代谢流量和产量。 

综合上述分析，本申请专利从上述2个关键步骤的关键限速酶调节入手，通过克隆ARO8、ARO10基因，并同时在S.cerevisiae中集成过量表达，构建高产β-苯乙醇工程菌，提高目的产物β-苯乙醇的代谢流量及产量，揭示L-苯丙氨酸分解代谢的分子调控机制。通过上述S.cerevisiae工程菌发酵L-苯丙氨酸转化制备β-苯乙醇香料，构型、手性单一，香气品质高，为天然β-苯乙醇香料制备提供了新思路和支持。 

发明内容

本发明提供一种产β-苯乙醇的酿酒酵母工程菌构建、菌株及其应用。以Saccharomyces cerevisiae S288c为出发菌株，设计构建β-苯乙醇合成代谢途径中关键酶基因(AR08、AR10)耦合过量表达的工程菌，增强主要合成途径中关键酶基因的表达；通过上述技术集成构建的工程菌(转化子)Paro8-10，经多次传代，遗传性稳定，β-苯乙醇的代谢通量与产量明显提高；工程菌Paro8-10在以L-苯丙氨酸为主要原料的培养基和优化发酵条件下可高效转化L-苯丙氨酸生产天然β-苯乙醇香料。 

生物材料样品保藏相关情况的说明 

生物材料样品保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 

保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。 

保藏日期：2012年12月11日。