[发明专利]负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法及利用该方法获得的负载干细胞的大面积羊膜贴片，以及所述负载干细胞的大面积羊膜贴片在制备治疗大面积褥疮或烧伤的医用材料中的用途。

背景技术

皮肤是人体与外界环境接触的屏障，不仅起保护、分泌、代谢和感觉等作用，而且参与免疫反应和维持机体内环境的稳定。截至目前，严重创伤和大面积烧伤患者的皮源缺乏一直是临床亟待解决的难题。组织工程皮肤产品开发的成功，使人工皮肤的研究实现了质的飞跃。目前，已经上市并应用于临床的组织工程皮肤产品有和等，有一定的临床效果，但仍有一些不足之处而且价格非常昂贵。

现有技术中关于组织工程皮片制备的方法主要有：

1、以成纤维细胞作为滋养层，培养人表皮细胞膜片，其脆性大，移植成功率低。

2、以胶原做支架，种植干细胞，构建组织工程化复合皮肤治疗皮肤溃疡。

3、用从胎儿脐带血中获取的血管原始祖细胞分化的内皮细胞构建的皮肤替代物，可以促进有免疫缺陷的患者皮损部位血管化的形成。

4、以包皮为细胞来源，采用消化法获得角质化细胞、成纤维细胞和黑素细胞，构建组织工程皮肤。

早期的烧伤创面覆盖可以限制细菌生长、预防感染、防止水分及电解质的丢失。自体皮肤移植是治疗烧伤的首选，但是对于大面积烧伤，自体皮肤不能满足需求，而异体皮肤能引起明显的免疫排斥。因而，组织工程化皮肤的研究已成为生命科学研究领域的热点之一。

人羊膜为半透明的薄膜，无血管、神经和淋巴管，有多种促进细胞增殖的营养成分，不表达人类白细胞抗原，具有抗微生物作用和较好的粘附性。目前已有用羊膜移植物治疗眼表损伤疾病的报道。但现有技术多采用直接剥离的羊膜，无任何处理。有的研究者在所述羊膜上负载了自体骨髓间充质干细胞。由于眼部面积较小，所以负载细胞的羊膜贴片很容易进行制备。但大面积负载细胞的羊膜贴片的制备由于受容器限制和其浸泡在培养基中的表面不平整，细胞不易生长，进而使其应用受到限制。

以往研究的组织工程皮肤覆盖物不仅价格昂贵，而且技术操作繁琐，有一定的技术难度并且成本造价较高。本发明要解决上述应用方面的不足，制备一种操作简单、使用方便、成本低且应用效果好的皮肤缺损修复贴片。由于脐带源间充质干细胞有多项分化潜能，能分化为上皮细胞，且羊膜与脐带为孕妇生产后的废弃物，患者自愿捐献不存在伦理问题。因此，如果能以简便方法制备负载间充质干细胞的大面积的羊膜贴片，将对大面积烫伤等皮肤疾病的治疗提供可资使用的基础材料，具有重要的经济意义和社会意义。

发明内容

因此，本发明的技术目的是找寻可以获取大面积羊膜贴片的方法。

因此，本发明的第一方面涉及一种负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法，其包括如下步骤：

1）将取自足月剖宫产产妇的废弃羊膜用PBS洗净，然后用0.5-5.0g/L的胰蛋白酶消化去除羊膜表面的上皮细胞，

2）选取厚度为1-4mm的玻璃板，切割打磨成能放入直径15-25cm的培养皿中的大小，

3）将稍大于上述玻璃板的羊膜铺在玻璃板上，多余部分内折，使表面尽量平整，用细胞刮刀反复刮几次去除残留细胞，将膜片连同玻璃板一同放入培养皿内，浸泡在α-MEM培养基或者DMEM培养基中，上皮面向上，4℃保存备用，

4）将培养好的干细胞以0.5-2×10⁴/cm²密度接种于上述处理好的羊膜上，培养至细胞贴壁，再加入10-50mL含10-20%血清的α-MEM培养基或DMEM培养基，细胞长满后待移植应用。

其中，所述大面积指面积在145cm²之上，优选地，所述大面积指面积在180cm²以上、200cm²以上、250cm²以上或300cm²以上。

优选地，步骤2）所述玻璃板的厚度为1.5mm，优选地，所述玻璃板不进行硅烷化处理。

优选地，步骤2）所述玻璃板的形状为圆形、方形、长方形，优选地，所述玻璃板的形状为圆形；优选地，所述玻璃板的大小与培养皿的大小尽量接近，以铺上羊膜后能置入培养皿为限；优选地，所述玻璃板的边缘进行打磨处理，以确保光滑、平整、无毛刺或玻璃渣；优选地，所述玻璃板的一面可以固定有大小小于所述玻璃板大小的突起物，以用于辅助固定羊膜，优选地，所述突起物为玻璃或聚丙烯材质，优选地，所述突起物为与玻璃板呈同心圆的圆形突起物或形成平面且使玻璃板平稳地水平置于培养皿中的至少3个栓状突起物。