[发明专利]致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒，其特征在于，包括包被有致敏性变应原的微孔板、辣根过氧化酶标记的抗人IgE抗体，化学发光底物液A和B，洗涤液；

其中，所述致敏性变应原为昆虫变应原、花粉变应原、真菌变应原或食物变应原中的一种或多种；

所述化学发光底物液A为含Luminol、TritonX100和化学发光增强剂的0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7~9；

所述化学发光底物液B为含H₂O₂的0.1M柠檬酸缓冲液，pH4~6；

所述洗涤液的成分为：NaCl 8g/L、KCl 2g/L、Na₂HPO₄·12H₂O2.87g/L、KH₂PO₄0.2g/L和Tween 200.5ml/L，以水配制。

2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述致敏性变应原包括屋尘螨和/或粉尘螨、蒿属花粉、豚草花粉、狗毛和/或猫毛、蟑螂、葎草花粉、霉菌混合、树花粉组合中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述霉菌混合为枝状枝孢、烟曲霉和/或链格孢混合，所述树花粉组合为柳树、杨树、圆柏、梧桐、洋白蜡和/或榆树组合。

4.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述致敏性变应原包括春季花粉Ⅰ、春季花粉Ⅱ、多价真菌Ⅰ、多价真菌Ⅱ、多价真菌Ⅲ、树花粉组合中的一种或多种；

其中，所述春季花粉Ⅰ为柳杉、杉木、杨树、榆树、柳树中的一种或多种；所述春季花粉Ⅱ为桦树、槭树、栎树、胡桃、油菜中的一种或多种；所述多价真菌Ⅰ为产黄青霉、黑曲霉、康氏木霉、总状毛霉、匐枝根霉中的一种或多种；所述多价真菌Ⅱ为匐柄霉、弯孢霉、大孢芽枝菌、蠕孢菌、面包酵母中的一种或多种；所述多价真菌Ⅲ为好食串株菌、玉米黑粉菌、禾谷镰刀菌、麦散黑粉菌、头孢菌中的一种或多种；所述树花粉组合为柳树、杨树、圆柏、梧桐、洋白蜡和/或榆树组合。

5.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述致敏性变应原包括夏秋花粉Ⅰ、夏秋花粉Ⅱ、蒿属花粉、葎草花粉、豚草花粉、多价真菌Ⅰ、多价真菌Ⅱ、多价真菌Ⅲ中的一种或多种；

其中，所述夏秋花粉Ⅰ为向日葵、苍耳、灰藜、大麻中的一种或多种；所述夏秋花粉Ⅱ为玉米花粉、高粱花粉、莎草花粉、蓖麻花粉中的一种或多种；所述多价真菌Ⅰ为产黄青霉、黑曲霉、康氏木霉、总状毛霉、匐枝根霉中的一种或多种；所述多价真菌Ⅱ为匐柄霉、弯孢霉、大孢芽枝菌、蠕孢菌、面包酵母中的一种或多种；所述多价真菌Ⅲ为好食串株菌、玉米黑粉菌、禾谷镰刀菌、麦散黑粉菌、头孢菌中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述致敏性变应原包括牛奶、蛋清、花生、大豆、腰果、鱼、虾、蟹、牛肉、羊肉、小麦面、芒果、苹果、橘子中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述化学发光增强剂为对碘苯酚、2-甲基-5-氨基-6羟基苯并噻唑、2-氨基-6-硝基苯并噻唑、1,3-二苯基苯酚中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液A的成分为：0.1M Tris-HCl缓冲液+1×10^-3～1×10^-5mmolLuminol+1μl～10μl/L TritonX100+0.1～50mmol化学发光增强剂，pH7~9。

9.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液B的成分为：0.1M柠檬酸缓冲液+30%H₂O₂，pH4~6。

10.制备权利要求1-9任一项所述诊断试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）包被有致敏性变应原的微孔板的制备：将包被用变应原加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μl，4℃过夜，用含Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤微孔板2遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液，室温静置2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存；

2）辣根过氧化酶标记的抗人IgE抗体的制备：采用改良的过碘酸钠法将羊抗人IgE抗体和辣根过氧化物酶联结在一起，具体为：

a.称取25mg HRP溶解于1ml双蒸水中；

b.向上述溶液中加入0.1M NaIO₄溶液1ml，室温下避光搅拌30分钟；

c.将上述溶液装入透析袋中，于1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜；

d.向经过透析的溶液中加入0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液，调pH至9.0～9.5，然后加入含有50mg羊抗人IgE的0.01M碳酸盐缓冲液5ml，室温避光搅拌2h；

e.将上述溶液装入透析袋中，于0.15M pH7.4的PBS液中4℃透析过夜；

f.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1h；

g.于3000rpm离心0.5h，收集沉淀，溶于少量0.15M pH7.4的PB缓冲盐溶液中透析，除去铵离子后，于10,000rpm离心30分钟，收集上清，即得；

3）化学发光底物液A和B以及洗涤液的配制：

化学发光底物液A的配制：在双蒸水中加入Tris和浓HCl配制成0.1M pH7~9的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入Luminol、TritonX100和化学发光增强剂，混匀；

化学发光底物液B的配制：在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH4~6的柠檬酸缓冲液，在此缓冲液中加入H₂O₂溶液，混匀；

洗涤液的配制：在双蒸水中依次加入NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄和Tween 20，混匀。