[发明专利]拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途

权利要求书

1.一种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系的保藏编号为CGMCCNo.5889。

2.一种拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞系分泌产生。

3.一种如权利要求2所述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、制备重组人VEGF蛋白为免疫原，具体为：PCR扩增得到编码人VEGF的基因片断，将其克隆到酵母表达载体中，获得表达质粒，转化酵母菌，筛选出高效表达工程菌株，工程菌株经发酵、诱导表达、分离纯化后，获得纯度达95％以上的VEGF蛋白；

步骤2、动物免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗人VEGF多克隆抗体；

步骤3、从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合；

步骤4、酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；

步骤5、阳性杂交瘤细胞经亚克隆鉴定得到多株稳定分泌抗人VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞；经再次亚克隆鉴定，筛选得到一株如权利要求1所述的杂交瘤细胞；

步骤6、将该杂交瘤细胞扩增培养，收集培养液，采用亲合层析法分离纯化抗人VEGF单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述小鼠皮下免疫的方法为：将所述纯化的重组VEGF蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射小鼠。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤6所述的亲合层析法具体为：将含单克隆抗体的杂交瘤细胞扩增后，接种于无血清的1640培养基中，37℃培养5天，随后上清过滤液后上样至含Protein G-Sepharose Fast Flow亲合层析；亲合层析柱经以PBS洗脱去除杂蛋白后,再以pH为2.7的甘氨酸液洗脱被吸附的抗体蛋白；洗脱液以1mol/L Tris(pH9.0)调节pH至7.0，再对10倍的体积的1x PBS透析12～16后，透析后的样品再经0.45μm滤膜过滤后即获得纯化的抗人VEGF单克隆抗体。

6.权利要求2所述的抗体在检测VEGF蛋白的应用。

7.权利要求2所述的抗体在制备治疗与血管增生有关疾病的药物制剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述与血管增生有关疾病包括横纹肌移植瘤、乳腺肿瘤。