[发明专利]抗菌肽依色格南的固相合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽药物合成技术领域，具体涉及一种含多对二硫键的抗菌肽依色格南的固相合成方法。 

背景技术

依色格南（Iseganan，氨基酸序列式如下所示）是猪中性粒细胞肽-1（Protegrin-1，PG-1）的类似物，能与细菌的胞外成分如脂多糖或脂膜酸等相结合，引起细菌膨胀、破裂，通过破坏细胞膜杀死细菌。其对革兰氏阳性、阴性细菌及真菌、酵母菌等均有抑制作用。对革兰阳性菌的MIC为0.13~0.16μg/mL，对于口腔黏膜炎相关的革兰阴性菌的MIC为0.063~8μg/mL。IntraBiotics公司正在开发依色格南的制剂配方，一项323名患者参与的III期临床试验表明，依色格南能预防口腔黏膜炎。接受依色格南治疗的患者口腔炎、口腔疼痛、咽喉疼痛及吞咽困难等症状显著减轻。 

依色格南氨基酸序列 

依色格南是含有4个Cys残基的抗菌活性17肽，整个分子具有β-发夹型（β-hairpin）构象。此类化合物主要作用于靶细胞的细胞膜，通过对膜上带负电的磷脂头部的吸引而聚集在膜表面进而传入膜中影响膜的完整性或是形成通道而使细胞膜破裂。活性结果表明其对多种革兰氏阳性、阴性细菌、真菌、酵母菌、真核原虫都有很强的抑制作用，并且对人红细胞溶血作用很小。 

已有大量的文献记载含多对二硫键的环肽合成。其合成路线可该概括为：先组装肽的主链序列，然后脱除半胱氨酸上的侧链保护基，使巯基游离，最后经适当的氧化条件， 如空气、H₂O₂、I₂、Hg²⁺盐、Fe³⁺盐、DMSO等，氧化生成二硫键。应该注意的是，在溶液中进行氧化成环时必须控制游离肽的浓度（一般在1mmol/L以下），否则会存在分子间搭桥的副反应。这就是分子内反应的稀释原则。在一些情况下，利用固相载体的假稀释效应（Pseudo-dilution effect，PDE）进行固相方式的氧化环合会得到比液相方式更好的效果。 

专利WO03/062266报道了固相与液相结合的依色格南合成方法。该方法中固相合成（1-8，9-17）两个片段，通过液相偶联两个片段后脱除保护基并氧化形成两对二硫键生成依色格南。依色格南是一个含有17个氨基酸的多肽，结构中并没有难以偶联的困难氨基酸，使用片段缩合会增加反应步骤，增加处理难度，降低产物的合成效率。并且该方法中4个半胱氨酸的巯基全部都是用Acm保护，使用碘的甲醇溶液脱除保护基并生成两对二硫键，使该方法不具备选择性形成（Cys^5-14，Cys^7-12）两对二硫键，难以合成正确结构的依色格南。 

专利CN102336813A报道了固相合成线性肽，然后再在液相中成环的方法。该方法在固相中合成线性肽，切除固相上全保护线性肽时脱除5和14位的半胱氨酸上的巯基保护基Trt后用双氧水氧化形成第一对二硫键（Cys^5-14）；再在碘的甲醇溶液中脱除7和12位的半胱氨酸上的巯基保护基Acm，并形成第二对二硫键（Cys^7-12）。此方法在切除固相上全保护线性肽时所用的高浓度TFA也会同时脱除部分Acm保护基，无法保证二硫键的正确配对。液相中成环需要高度稀释以防止分子间的二硫键的形成，因此增加后处理的难度，降低生产效率，无法满足大规模的工业化生产要求。 

鉴于依色格南重要的药学应用价值，有必要提供更有效的依色格南合成方案，能够克服以上方法的缺陷并适合工业规模的生产。 

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种新的依色格南制备方法，该方法能够克服现有制备方法的不足与缺陷，并适合工业化生产。 

发明方案：本发明的技术方案包括以下步骤： 

（1）按照固相合成的方法，氨基树脂在Fmoc脱保护试剂作用下脱去Fmoc后，在 偶联体系作用下于反应溶剂中按肽序依次连接Fmoc氨基酸，合成保护的十七肽树脂，第5位和第14位半胱氨酸上保护基相同，第7位和第12位半胱氨酸上保护基相同，两组保护基中一组保护基X₁为Xan，Tmob或Mmt，另一组保护基X₂为Acm; 

（2）脱除半胱氨酸上保护基X₁，氧化生成第一对二硫键； 

（3）脱除保护基X₂并环化生成第二对二硫键； 

（4）脱除N端保护基，从树脂上裂解并去除侧链保护基，纯化后得依色格南抗菌肽。