[发明专利]一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品培育技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌病俗称鸭传染性浆膜炎，鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA)感染病是鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种高致病性、接触传染性疾病，是严重危害2～7周龄雏鸭和幼龄鸭的一种细菌性传染病。本病以10～35日龄的雏鸭发病较多，发病率最高可达90%以上，死亡率为5%～75%，是影响鸭养殖业的重大传染病之一。该病广泛存在于世界各地的养鸭场，鸭场一旦发生该病则很难彻底清除感染。目前该病的控制主要依靠抗生素治疗，但随着该菌对多种抗生素耐药性的不断增加和食品安全的需要，研制疫苗以提前预防该病的需要越来越迫切。

鸭疫里默氏杆菌血清型众多，目前世界范围内已确定的有21种，各血清型之间的交叉保护作用差，这就要求使用疫苗的抗原血清型必须与生产中的流行菌株的血清型一致。我公司对全国各地分离到数百株RA分离株的血清型进行了深入研究，研究结果表明流行菌株的优势血清型是血清2和10型。为此，我们对血清2和10型RA的灭活疫苗进行了研究。

另外，疫苗中的免疫佐剂对疫苗的质量和效果起着重要的作用，免疫佐剂与抗原同时应用，可增强机体针对抗原的免疫应答能力，或者改变免疫反应的类型。目前疫苗中应用的免疫佐剂多为白油佐剂、氢氧化铝佐剂、类脂佐剂和蜂胶佐剂等。白油佐剂免疫原性好，但是毒副作用大；氢氧化铝胶佐剂免疫原性好，副作用小，但不能诱导细胞免疫；类脂佐剂和蜂胶佐剂免疫原性好，可诱导体液免疫和细胞免疫，免疫持续时间长，但原材料价格昂贵。单一应用以上任何一种免疫佐剂，均存在不同的缺陷，不同程度的制约了其推广应用。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，而提出了一种鸭疫里默氏杆菌二价复合佐剂灭活疫苗的制备方法，该方法较好的解决了鸭疫里默氏杆菌疫苗的制备问题，使得鸭疫里默氏杆菌疫苗的生产方法更加简单，产品质量更加稳定，并且制备了新型的复合免疫佐剂，辅以优质抗原，增强了产品的免疫效果。

本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的：

（1）制备种子液：将沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌2型GD-2株和沃华研发中心保种的鸭疫里默氏杆菌10型GN19株分别接种于改良酵母琼脂血平板进行培养，在37℃下培养24小时，挑取单菌落于改良酵母琼脂血平板纯化一代，选5～10个典型菌落接种于改良酵母液体培养基，在37℃下振荡培养24小时，得到种子液，用显微镜进行纯粹检验，将检验合格的作为种子，放入冰箱于2～8℃下保存备用。

（2）制备制苗用菌液：在改良酵母液体培养基中接入步骤（1）得到的种子液，接入量为液体培养基量的2%～5%，37℃下培养8～12小时，对菌液进行检验提纯，选取活菌数不低于2×10¹⁰CFU/ml的菌液；

（3）灭活：将步骤（2）得到的制苗菌液中加入菌液量0.3%的甲醛溶液，在37℃下灭活24～48小时，然后进行活菌检验，至活菌生长；

（4）制备复合佐剂：取占最终疫苗质量15%的氢氧化铝胶，用生理盐水溶解，将杨树皮类脂和免疫增强剂按比例加入，其中杨树皮类脂佐剂加入量为最终疫苗质量的4-6%，免疫增强剂用量为最终疫苗质量的1-3%，用均质机混合均匀，即得免疫复合佐剂。

（5）制备疫苗：在步骤（3）得到的制苗的灭活菌液与免疫复合佐剂混合，以3000rpm转速搅拌30分钟，运行完毕，疫苗降温至室温，分装，得到疫苗成品。

其中以上本发明中所述的改良酵母液体培养基组成成分为牛肉膏、蛋白胨 、水解乳蛋白、酵母浸粉、氯化钠，其中制作方无法为各成分按重量百分比牛肉膏︰蛋白胨︰水解乳蛋白︰酵母浸粉︰氯化钠为3～5%︰3～5%︰3～5%︰2～3%︰2.3～3.5%，用蒸馏水溶解，并定容，pH值调整为7.2，在116℃下灭菌30分钟制成。

其中上述步骤（5）中灭活菌液与免疫复合佐剂的混合比例，根据每次培养的细菌中抗原的含量而定，使最终疫苗中抗原含量：2型抗原为35亿/ml，10型抗原为50亿/ml，铝胶15%，类脂5%，免疫增强剂2%。