[发明专利]人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞的体外培养领域，更具体地，本发明涉及一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法。

背景技术

肺泡II型上皮细胞(alveolar epithelial type II cells，ATII)作为一种组织干细胞，具有十分重要的功能，主要包括5个方面：①作为渗透性屏障阻止组织间隙的大分子物质流入肺泡腔；②具有一定组织干细胞功能，在肺损伤修复过程中，除可以自身增殖外，还可分化成为肺泡I型上皮细胞和成纤维细胞；③能分泌肺泡表面活性物质；④能分泌抗炎、抗菌物质，在免疫方面起作重要作用；⑤能进行跨上皮细胞的钠离子转运，有助于肺泡液体的清除。可见对其进行体外培养研究是十分必要的。

自Dobbs等首次报道对成年大鼠肺泡II型上皮细胞提取方法以来，有许多学者进行了这方面的研究，使得该分离培养技术也更加的完善，但体外培养的ATII细胞很快失去表达表面活性质的情况仍然存在，并很快会分化为I型肺泡上皮细胞。尽管分离培养大鼠和人ATII细胞的方法，在十九世纪八十年代已有报道，且在后来的培养方法中也有所完善，然而在维持ATII细胞表型方面仍存在明显不足，如体外培养的ATII细胞很快失去表面活性物质表达特性。而肺腺癌细胞系A549又不具有分化为肺泡I型上皮细胞和成纤维细胞的潜能，失去了ATII细胞的绝大部分特征。同时也有研究表明人和动物的ATII细胞的生物学特性是有差异的，如不同物种间水通道蛋白(AQPs)表达不同。

现有的人肺泡II型上皮细胞分离培养方法是取适量手术后肺组织，剪碎成约1mm³大小后，进入消化过滤步骤，然后进行差速贴壁培养，密度梯度离心及磁珠分选纯化获得人肺泡II型上皮细胞。现有的方法中，消化步骤采用的胰酶和弹性蛋白酶浓度过高，对ATII细胞损伤较大，而且成本较高昂。差速贴壁的时间较短，为1.5h，还包括应用磁珠分选去除成纤维细胞和巨噬细胞的步骤，整个实验操作时间过长，至少需要12h工作；提取肺泡II型细胞的肺组织量仍较多，未予以充分利用；实验花费成本高昂。

由此可见，人的肺组织作为提取ATII细胞的组织来源，一方面组织来源有限，另一方面体外培养表型维持时间较短，这极大地限制了ATII细胞的体外培养，以至于国内尚未见这方面研究的报道。因此，为了研究人的ATII细胞的功能，分离纯化、体外培养人ATII细胞是十分必要的。

发明内容

基于此，本发明提供了一种新的肺泡II型上皮细胞的分离培养方法。

一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)将手术切除边缘肺组织剪碎，BSS洗涤，经细胞筛过滤，留取筛网上组织；

(2)加入25-35ml组织消化液，36-38℃消化35-55min，在后10-20分钟加入1-2ml浓度为10⁴U/mL的Dnase I；每L所述组织消化液的组成为：浓度为10⁵U/mL的胰酶2-3ml，浓度为44.5mg protein/mL的弹性蛋白酶200-500ul；

(3)加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化，滴管吹打，得到细胞悬液；加入BSS稀释细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；每L所述抑制液的组成为：DMEM/F-1230-60ml，FBS10-20ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1-2ml；

(4)采用36-38℃预热的粘附培养基重悬细胞，置于36-38℃、3-5％CO₂、相对温度90-95％的环境下培养2-3h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2-3h；每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F-1222.5-45ml、SAGM22.5-45ml、FBS5-10ml、浓度为10⁴U/ml的DNase I1-2ml；

(5)离心收集未贴壁细胞，用DMEM/F-12重悬细胞，并吹打均匀，缓慢加入轻、重分离液的顶部，密度梯度离心；所述轻、重分离液的体积比为1∶1；所述轻、重分离液的密度分别为1.040g/ml和1.089g/ml；

(6)滴管吸出轻、重分离液界面处的细胞层，BSS洗涤；Anti-CD14MicroBeads分选去除巨噬细胞，得到分选液；