[发明专利]一种兽用抗生素阿维拉霉素分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种兽用抗生素阿维拉霉素分离纯化的方法，属于工业生物技术、生物医药领域。

背景技术

阿维拉霉素（Avilamycin）是由绿色产色链霉菌（Streptomyces viridoehrongenes）发酵而成的二氯异扁枝衣酸酯，属于正糖霉素族的寡糖类抗生素。它主要抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌效果较差，是一种新型的抗菌促生长剂。在畜禽业中，因其安全性高、不存在交叉耐药性及良好稳定的促生长效果，越来越受到人们的重视。阿维拉霉素是一种混合型低聚糖类抗生素，目前发现有A、B、C、D、F、G、H等多种结构。其中最具活性的是阿维拉霉素A组分，分子式为C₆₁H₈₈Cl₂O₃₂，分子量为1403；其次为阿维拉霉素B，分子式为C₅₉H₈₄Cl₂O₃₂，分子量为1375；其他成分活性很小，在链霉菌中含量也很低。

阿维拉霉素的分离纯化方法主要是通过脱色、结晶、过柱等几个步骤来完成，但是目前相关研究还很少，技术很不成熟，市场上阿维拉霉素的纯品几乎没有。国内大部分企业和用户均以已知含量的预混剂作为对照品来控制生产，导致分析结果产生较大偏差。所以制备阿维拉霉素单组分纯品可以为含阿维拉霉素样品的检测提供有效保障，对阿维拉霉素的研究和生产具有重大的现实意义。

发明内容

本发明要解决的问题是：克服现有技术中阿维拉霉素分离纯化技术的不足之处，提出一种可行的兽用抗生素阿维拉霉素分离纯化方法。

为解决该技术问题，本发明的技术方案是：

提供一种兽用抗生素阿维拉霉素分离纯化的方法，包括以下步骤：

（1）阿维拉霉素菌丝体经过浸提、结晶得到阿维拉霉素粗提物

将含有阿维拉霉素的菌丝体加入有机试剂中，在温度不超过40℃的条件下超声90~120 min，3000 r/min条件下离心10 min，得上清液即为浸提液；按浸提液∶水的体积比为1∶1~ 1∶2进行补水结晶，4000 r/min条件下离心15 min，40℃下烘干得阿维拉霉素粗提物；

所述有机试剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙脂、乙腈或氯仿中的一种或几种的组合，阿维拉霉素菌丝质量与有机试剂体积之比为1∶30~ 1∶50；

（2）阿维拉霉素粗提物经过硅胶柱层析得到阿维拉霉素A和B的混合物

以3%的2-丙醇氯仿溶解阿维拉霉素粗提物，上硅胶柱。在1 mL/min的流速下以3% 的2-丙醇氯仿洗脱；阿维拉霉素粗提物∶硅胶的质量比为1∶50~1∶70；

采用硅胶厚度为0.2 mm的硅胶HF254板进行薄层层析色谱（TLC）追踪斑点，根据斑点位置进行分段收集；目标部分的洗脱液在40℃下旋转蒸发并烘干得到阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的混合物；

（3）阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的混合物过十八烷基键合相硅胶（ODS）柱分离得到阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的纯品

取80~120 mg阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的混合物，以乙腈溶解后上ODS柱，ODS质量为100 g；采用乙酸铵水溶液-乙腈溶剂体系为洗脱液，在1 mL/min的流速下进行洗脱，洗脱液中乙酸铵水溶液与乙腈的体积比为55∶45；

采用硅胶厚度为0.2 mm的硅胶HF254板进行薄层层析色谱（TLC）追踪斑点，根据斑点位置进行分段收集；目标部分阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的洗脱液分别按洗脱液∶水的体积比为1∶1~1∶2进行加水重结晶，抽滤后结晶用纯水漂洗，40℃下烘干后即获得阿维拉霉素A和B阿维拉霉素纯品。

作为一种改进，步骤（1）中所述浸提用的有机试剂为体积比1∶1的甲醇和氯仿混合液。

本发明所得阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的纯品的平均得率为37.50%。并且阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的纯度在98%以上。

本发明与现有技术相比，具有如下特点：

（1）本发明最终得到的纯品分别是阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的纯品，而不是阿维拉霉素各组分混合的纯品；（2）本发明纯化步骤简便，易操作；（3）本发明获得阿维拉霉素A和阿维拉霉素B纯品的平均得率在37.50%以上，与其他阿维拉霉素分离纯化方法相比有所提高；（4）本发明获得的阿维拉霉素A和阿维拉霉素B纯品的纯度在98%以上，在阿维拉霉素测定中可作为对照品。

具体实施方式

本发明的实现路线是：