[发明专利]可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物、试剂盒及其定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒分子生物学检测和鉴定技术领域，尤其涉及一种植物病毒检测用引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）是今年来严重危害水稻的一种新病毒。2009年以来，在我国南方主要水稻种植区爆发成灾，仅2010年，南方水稻黑条矮缩病毒病发生面积就达到1400多万亩，严重威胁到我国水稻的安全生产。

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarfvirus，SRBSDV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus），病毒粒体球状，基因组由10条双链RNA(dsRNA)组成，由白背飞虱（Sogatella furcifera Horvath）以持久性方式传播。侵染水稻症状表现为植株矮缩、叶色深绿、高位分蘖、茎秆出现乳白色或浅褐色点条状突起，茎节上出现气生须根。SRBSDV主要浸染禾本科作物和杂草，如水稻、高粱和玉米以及看麦娘等，病害发生严重时能导致作物绝收。

由于SRBSDV是近年来水稻上分离并命名的一种新病毒病，目前，检测的方法主要是病害症状鉴别、血清学技术和常规RT-PCR技术。病害症状鉴别主要根据SRBSDV浸染水稻的典型症状来鉴别，但在SRBSDV浸染水稻早期，水稻不会表现典型症状，因此，如果单凭病害症状鉴定该病害，则SRBSDV造成的损失可能已无法避免。血清学技术主要依据SRBSDV编码的蛋白作为抗原，与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。而常规RT-PCR技术则通过将目的DNA片段扩增至数十万倍乃至百万倍，直至肉眼能够直接判断。然而，现有的技术均不能定量地检测SRBSDV病毒含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物和试剂盒，还提供一种精确度高、稳定性好、重复性好、特异性强、灵敏度高的定量检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列如下所示：

上游引物：CTTTGACCGAGATGAGC；

下游引物：ACCTTCGTGAATGATGTT。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的试剂盒，包括以下组成试剂：

包含上述引物的引物溶液；

阳性标准样品；

RNA提取试剂盒；

cDNA合成反应体系；和

实时荧光定量RT-PCR反应体系。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种定量检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括以下步骤：

（1）合成上述的引物；

（2）利用RNA提取试剂盒从待测农作物样品中提取其RNA；所述农作物包括水稻、高粱、玉米、看麦娘等；

（3）以步骤（2）中提取的RNA为模板，利用cDNA合成反应体系合成cDNA；

（4）制备阳性标准样品，该阳性标准样品经实时荧光定量PCR反应程序绘制得到荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线；

（5）以步骤（3）中合成的cDNA为模板，添加荧光染料和步骤（1）中合成的引物配制实时荧光定量RT-PCR反应体系，通过实时荧光定量RT-PCR反应程序进行扩增反应，在每个反应循环的延伸温度步骤采集荧光信号（采集的信号值，通过信号值可以确定对应的循环数），最后根据步骤（4）中建立的荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线，测得待测农作物样品中南方水稻黑条矮缩病毒的起始浓度值。

上述方法的步骤（3）中，合成cDNA的具体方法优选包括以下步骤：将RNA free水、随机引物六聚体和所述提取的RNA混匀，置于变性温度65℃，4min～6min；取出置于冰上，然后加入M-MLV反转录酶、M-MLV Buffer、dNTP Mixture和RNA抑制剂，进行RT反应合成cDNA。