[发明专利]一种用枯草芽孢杆菌生产靛蓝色素的方法

权利要求书

1.一种生产靛蓝色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌株发酵培养：将枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC5698的种子液接入已灭菌的液体发酵培养基中，于26-34℃恒温培养46-60h，摇床转速200r/min；

(2)提取枯草芽孢杆菌靛蓝色素。

2.如权利要求1所述的一种生产靛蓝色素的方法，其特征在于，所述菌株发酵培养18h后加入吲哚乙醇溶液，使发酵液中吲哚浓度达到180mg/L。

3.如权利要求1所述的一种生产靛蓝色素的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成，以重量体积百分比计，单位g/100ml，其中蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，(NH₄)₂SO₄0.25，MgSO₄·7H₂O0.01，FeSO₄·7H₂O0.04，NH₄NO₃0.1，pH为7.0-9.0。

4.如权利要求1所述的一种生产靛蓝色素的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌CGMCC5698的种子液的制备方法如下：将平板培养所得的单菌落接入种子液培养基于30-34℃下恒温培养18小时，摇床转速为180r/min；所述种子液培养基的组成，以重量体积百分比计，单位g/100ml，其中蛋白胨1，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，NaCl0.2，(NH₄)₂SO₄0.2，NH₄NO₃0.1，K₂HPO₄0.01，MgSO₄·7H₂O0.01，pH7.5。

5.如权利要求1或2或3或4所述的一种生产靛蓝色素的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌CGMCC5698在接种前还经过平板培养，在LB固体培养基上于30-37℃恒温培养，所述LB固体培养基组成，以重量体积百分比计，单位是g/100ml，其中蛋白胨1、酵母粉0.5、NaCl1，pH值为7.2。

6.如权利要求1所述的一种生产靛蓝色素的方法，其特征在于，所述发酵培养温度为32℃。

7.如权利要求1所述的一种生产靛蓝色素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取枯草芽孢杆菌靛蓝色素的过程是：发酵结束后，将发酵液于室温下12000r/min，离心15min，收集深蓝色的菌体沉淀物；上清液加入等体积的丙酮，反复震荡萃取后，12000r/min离心10min，收集含有靛蓝色素的丙酮层；收集的菌体沉淀物用60ml20mmol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液震荡吹打悬浮，再12000r/min，离心10min；如上反复洗涤3次，将非菌体杂质洗掉，离心后的菌体用40ml的丙酮充分悬浮菌体，再在冰浴状态下采用超声法破碎菌体细胞；超声功率600-800W，工作时间18s，间歇20s，工作次数25-35次；第一次超声破碎后的悬浮液10000r/min离心10min，得到蓝色的上清液和深色细胞碎片沉淀；再次向细胞碎片沉淀中加入丙酮10ml，重复以上超声破碎细胞步骤1-2次；最后将每次超声破碎后获得的蓝色上清液以及丙酮萃取的发酵上清液合并；采用旋转蒸发仪浓缩，然后真空冷冻干燥除掉残余丙酮，得到靛蓝色素。