[发明专利]食品和饲料中安康鱼及其制品实时荧光PCR鉴伪方法

说明书

技术领域

本发明属于食品质量控制领域，具体涉及一种食品和饲料中安康鱼及其制品实时荧光PCR鉴伪方法、其建立方法及应用。

背景技术

我国山东辽宁等沿海城市，安康鱼资源比较丰富，每年的加工出口量可以达到10万吨，出口方向主要是日本、韩国和欧洲。近年，受美国对中国产品实施严格检验的影响，特别是由于我国福建宁德地区出口美国的安康鱼混杂河豚鱼导致消费者中毒死亡后，我国出口日本的产品又一次遭受壁垒。为了尽量减轻安康鱼产品国际贸易的不良影响，我国各有关企业，一方面更加严格的要求对原料进一步加强验收措施，避免有毒鱼种混入原料中。另外，对员工进行严格培训，掌握鉴别河豚鱼等有毒鱼种的方法、技巧，一旦发现异常立即采取适当措施处理并报告。力求避免国外采取更加严厉的措施，对贸易造成更加不利的影响。

由此，急需安康鱼类品种鉴定的简便、快速的方法。目前我国在食品和饲料中安康鱼及其制品的鉴伪方法仍是个空白，关键在于保证方法稳定性、特异性等方面存在很多困难，这也是制约方法建立的瓶颈。

为开展食品质量控制，为使分析测定结果准确、可靠、保证数据的质量，荧光PCR法是一个简便、有效的方法，具有切实可行的实用价值。但目前国内外，尚未有高可信度的食品和饲料中安康鱼及其制品的检测方法，检验间的结果差别较大，这就造成食品和饲料中安康鱼及其制品检验的随意性和不确定性。但由于人们对食品的安全卫生特别重视，食品卫生指标尤其是食品和饲料中安康鱼及其制品的真伪鉴定就显得特别重要。食品和饲料中安康鱼及其制品实时荧光PCR鉴伪方法，对于食品贸易的要求等方面均具有特殊重要的意义。

发明内容

为了解决上述实际问题，本发明建立了一种食品和饲料中安康鱼及其制品实时荧光PCR鉴伪方法，采用TaqMan探针技术，对食品中安康鱼源性成份进行鉴定。该标准的研制成功及推广应用对提高食品中安康鱼源性成份的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验检疫技术具有重要意义。

本发明从以下几个方面研究：提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用安康鱼品种的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，直接读取实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和原料中安康鱼及其制品的鉴伪检测等，在此基础上，进行了特异性和稳定性检测；

本发明的具体技术方案如下：

本发明所述的安康鱼，俗名蛤蟆鱼、老头鱼、结巴鱼、丑婆、海鬼鱼等，属于鱼纲，安康目，安康科。体柔软，无鳞，头和体的边缘有许多皮质突起。

本发明的一方面在于：公开一种安康鱼成分检测用引物与探针，其包括以下碱基序列：

针对安康鱼线粒体DNA细胞色素氧化酶I(Cytochrome oxidase subunit I，COI)基因序列设计安康鱼检测用引物与探针。

COI基因序列对应Genebank的登陆号：EU660706.1。

本发明的另一方面在于：一种安康鱼成分检测试剂盒，其包括上文所述的安康鱼成分检测用引物与探针。

本试剂盒中还可以包括阳性对照、阴性对照、空白对照。其中，阳性对照可以选择安康鱼提取的DNA，内参照可以选择真核生物18SrRNA基因DNA，阴性对照可以选择不含有安康鱼的样品提取的DNA，空白对照可以选择灭菌水，也可以每组各设置两个或多个平行的反应体系。其中，

质量控制标准为：以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

(a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

(b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

(c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。

(d)内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0

结果判定标准为：在符合质量控制标准的情况下，被检样品进行检测时：如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性。如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性。如35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值≥40.0，则判定被检样品阴性。

本发明的另一方面在于：一种安康鱼及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其利用上文所述的引物与探针，对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测。

对于上文所述的安康鱼及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，所述的实时荧光PCR方法较优的选择如下：