[发明专利]基于离心微流控技术的稀少细胞分离检测系统及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于离心微流控技术的稀少细胞分离检测系统及使用方法，可应用于无创产前诊断、肿瘤早期诊断和预后监测以及干细胞研究等领域。

背景技术

从复杂混合物中选择性地分离稀少细胞在细胞生物学和临床方面都具有重要意义，比如从母体外周血中分离胎儿红细胞、患者外周血中分离循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell,CTC）以及骨髓或组织中分离干细胞等，这些细胞的分析往往能给临床诊断和疾病的治疗提供非常有价值的信息，但是这类细胞在样品中的含量非常稀少，通常仅为1~10个/mL，分离提取非常困难，因此大大限制了其临床应用。传统的稀少细胞分离富集技术主要有密度梯度离心法、过滤分离法和免疫磁珠分选法等。其中密度梯度离心法和过滤分离法均是借助各种细胞的物理特性差异（比如密度、大小）来筛选和富集目标细胞，但是这类基于细胞物理特性来进行分离富集的方法特异性较差，所得样品纯度较低，其风险在于经常会导致疾病诊断的错误。免疫磁珠分选法是目前最为常用的稀少细胞分离富集方法，其基本原理是利用稀少细胞表面抗原与连有免疫磁珠的单克隆抗体特异性结合，在外加磁场作用下实现稀少细胞的分离富集。这种方法将抗原抗体反应的高度特异性和免疫磁珠的富集分离作用相结合，具有简便、灵敏、快速的特点，且分离纯度高，产率大，不影响被分离细胞的活性。但是这种方法应用于稀少细胞的富集方面，仍有许多不足。一方面，传统的基于磁力的分离方法，往往采用离心管操作，由于相对于磁珠所受磁力，其平均沉降路径较长（几个mm~1cm），因此磁珠-细胞复合物完全沉降所需时间较长，分离效率较低，且因磁珠所受磁场作用力相对较弱，基本与流体剪切力一个量级，容易导致部分磁珠或磁珠-细胞复合物被洗涤液一起带走，影响检测结果的准确性；另外，在检测过程中，分离富集的细胞往往需要转移到新的容器或平板上进行检测，往往容易导致部分靶细胞因转移损失被遗漏。因此，为了提高并改善稀少细胞分离检测的特异性及敏感性，国内外很多研究机构及企业都致力于研究新的稀少细胞分离富集方法和设备，尤其是基于微流控技术的稀少细胞分离方法近年来得到迅速发展。其中最引人注目的是哈佛医学院报道的基于微流控技术的CTC分离方法，该方法利用微流体芯片技术成功地分离检测到肿瘤病人体内的少量CTC[Nagrath S,Sequist LV,Maheswaran S,et al.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.Nature.2007,450:1235-1241.]，肿瘤细胞捕获效率高达99%，分离纯度约为50%。所用微流控芯片以硅为基片，采用光刻、等离子体深刻蚀、键合等工艺加工制作，该芯片包含了78，000个硅基微柱，通过在微柱上包被抗EpCAM抗体，使得当血液流经微柱时其中所含的CTC被免疫捕获，最后再用免疫荧光方法原位标记CTC并对其计数，实现CTC的检测。由于该方法无需全血标本的预处理，同时操作过程简单温和,对细胞损伤比较小，避免了分离纯化及反复离心洗涤的繁琐步骤，且检测灵敏度高，显示了很好的应用前景。尽管如此，该方法仍存在较大不足：一方面，为了保证细胞的捕获效率，考虑流体剪切力、流体流形空间分布等因素影响，血液样本在芯片中必须维持较慢的速度（~1mL/h），因此该方法检测过程耗时较长（5~7小时），效率较低。另一方面，所用芯片采用不透明的硅基制作，不利于光学检测，且芯片中微柱的等离子体刻蚀加工，需要昂贵仪器，制作成本较高，限制了其临床的大规模应用。虽然，最近有人力图改进这一方法[Wang S,Liu K,Liu J,et al.Highly Efficient Capture of Circulating Tumor Cells by Using Nanostructured Silicon Substrates with Integrated Chaotic Micromixers.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50:3084–3088.]，比如通过调节免疫捕获微柱间距和排列或在微管道中增加斜纹脊形微结构优化微流控芯片中CTC捕获效率，但改进效果有限，仍然无法同时满足高效捕获和快速分离的要求。因此，急需发展一种易于操作、可实现稀少细胞快速高效分离的系统。从而成为本发明的构思。

发明内容