[发明专利]乳酸乳球菌N8 Nisin免疫耐受相关基因irpT及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关基因，即irpT基因。 

背景技术

乳链菌肽Nisin高效、安全、无毒，是国际公认的最为安全的生物防腐剂，广泛应用于食品和医药行业，对于提高食品安全性、防治细菌性疾病有着重要作用。Nisin可以抑制绝大多数革兰氏阳性菌，主要通过抑制细胞壁合成，即形成穿膜孔道、引起胞内小分子物质外泄、诱导细菌自溶酶释放或抑制孢子形成四种方式。为避免对自身菌体的破坏，由Nisin基因簇编码的NisI和NisFEG四个蛋白协同作用，为产Nisin的乳酸乳球菌提供了免疫保护。但近几年的研究表明，不产Nisin的乳酸乳球菌也可以被诱导产生对Nisin的耐受性，说明Nisin的免疫耐受系统是一个复杂的调控网络。 

因此，在Nisin基因簇中的基因，乳酸乳球菌中还有很多基因参与免疫耐受性的调控。有许多基因共同参与，这些基因的功能有的是已知的，有些还有待研究，对Nisin免疫耐受性相关基因的研究有助于了解Nisin免疫耐受性的网络调控机制，通过对Nisin耐受相关新基因的深入研究，可以进一步解释Nisin耐受的网络调控机制，为构建Nisin基因工程菌、提高Nisin工业产量、降低生产成本提供理论指导，有着重要的理论和现实意义。 

发明内容

本发明目的是提供与乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关的基因，即irpT基因，为构建Nisin高产的基因工程菌提供理论依据。 

本发明提供的乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关的基因irpT基因，具有如序列表所示核苷酸序列，其基因长度为708bp。 

上述的提供的乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关的irpT基因，可以进一步解释Nisin耐受的网络调控机制，并且为构建Nisin高产的基因工程菌提供理论依据。 

本发明基因的获得方法：使用人工Mu转座技术（一种基于噬菌体Mu转座子的转座技术），造成乳酸乳球菌N8基因突变，建立突变子文库。筛选Nisin耐受增强的突变子，使用限制性内切酶PvuⅡ对基因组DNA,酶切，酶切片段与pUC18载体连接，通过电转化将连接产物导入大肠杆菌DH5α，用氨苄青霉素LB平板筛选阳性转化子，测定转化子中插入片段的核苷酸序列，发现Mu插入的基因，确定此基因与Nisin免疫耐受有相关性。 

本发明的优点和有益效果： 

实验发现本发明基因的失活能够增强乳酸乳球菌对Nisin的免疫耐受性。 

Mu插入失活基因使细菌对Nisin的免疫耐受性显著增强，说明此基因与乳酸乳球菌Nisin的免疫耐受性相关，这可以进一步解释Nisin耐受的网络调控机制，并且为构建Nisin高产的基因工程菌提供理论依据。 

通过本发明，可以针对irpT基因设计突变及敲除方法，限制其正常表达，使得乳酸乳球菌对Nisin的免疫耐受性显著增强，利于工业上的高效发酵生产。 

附图说明

图1是乳酸乳球菌N8和乳酸如球菌irpT::Mu N8 Nisin MIC（IU/ml）检测。 

图2是Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)； 

泳道1为负对照，模板为乳酸乳球菌N8基因； 

泳道2为正对照，模板为Mu转座子DNA的质粒pLEB620； 

泳道M为DNAmarker； 

泳道4-6为随机挑选的乳酸乳球菌N8突变株。 

用EeyMu1和EeyMu2作为引物，可以扩增出730bp的特异性片段，确认Mu转座复合物DNA片段的存在。 

图3是乳酸乳球菌N8irpT::Mu N8基因组单点插入Southern杂交检测； 

泳道1为PvuII酶解的乳酸乳球菌N8基因组； 

泳道2为红霉素Mu转座子片段； 

泳道3为PvuII酶解的乳酸乳球菌N8 irpT::Mu N8基因组； 

泳道4为EcoRI酶解的乳酸乳球菌N8 irpT::Mu N8基因组。 

具体实施方式

实施例1：使用Mu转座技术进行突变子文库的建立 

(1)Mu转座复合物的制备: