[发明专利]家畜精原干细胞培养液

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种家畜精原干细胞培养液。 

背景技术

精原干细胞(SSCs)是最重要的成体干细胞之一。精原干细胞不仅有传宗接代的遗传功能，近来研究显示，精原干细胞很容易通过退分化产生多能干细胞。这使得精原干细胞操作技术得到生命科学、农业科学和医学各路专家的垂青【1】。自从精原干细胞移植技术【2，3】建立以来，精原干细胞的研究得到了空前的发展。近年来又建立了小鼠和大鼠精原干细胞的体外长期培养方法【4，5】。若要在体外对精原干细胞进行操作，那么首先就要对精原干细胞进行分离和纯化培养。在小鼠睾丸内的全部生殖细胞中，仅有0.03％是干细胞【6】，因此对精原干细胞进行分离和纯化是培养精原干细胞关键的一步。国内精原干细胞的研究近几年取得了较大的进展。上海交通大学吴际团队在小鼠精原干细胞的自我更生、增殖培养、冷冻储存及睾丸移植等方面的研究取得了好成果【7，8】。 

精原干细胞不仅在生殖生物学研究中具有重要价值，也是转基因动物技术研究的新的方向【9】。制作转基因动物的方法有多种。当前常用的制作转基因动物的方法有两种：DNA原核显微注射法和核移植法。这两种方法的共同点是，都进行胚胎操作；不同点是，外源基因的重组整合时间点不同。原核显微注射法外源基因的重组整合在胚胎显微操作之后，外源DNA只能随机整合，无选择余地，因而产生嵌合体的比例高，产生生殖系遗传的比例低，转基因的表达水平在不同个体中差异大。最大的弱点是成功率低。因此家畜转基因操作已经不用DNA原核显微注射法。核移植法转基因，也称转基因克隆，外源基因的重组整合发生在胚胎显微操作之前，先筛选基因重组体细胞做为供体再进行 核移植，因而保证产生的转基因动物具有生殖系遗传特性。但是，核移植法也有它的弱点，除了效率低之外，还常伴有出生体重超常和生理不正常等。核移植过程不能避免表观遗传改变的影响，也使转基因克隆动物对外源基因的表达存在不确定性。用精原干细胞移植法制作转基因动物，既可以先筛选基因重组的精原干细胞，又不会受表观遗传改变的影响。因为精原干细胞在长期培养过程中具有卓越的稳定性和增殖潜能，它们有一个独特的机制，能防止已损坏的遗传基因和表观遗传性状传播给后代。这些特性使精原干细胞成为具有吸引力的目标生殖系的遗传修饰【10】。这些研究结果说明用精原干细胞移植法制作转基因动物具有内在的优点。 

精原干细胞冷冻储存是雄性动物种质资源保存研究的新的分支。至今为止哺乳动物种质资源都是用卵母细胞冷冻保存。一旦精原干细胞长期培养方法和冷冻储存方法都建立起来了，雄性动物的种质资源就有保存方法了，而且比卵母细胞的保存简便，复苏后又可以增殖扩大培养。如小鼠精原干细胞经过2年多的培养，超过(增殖超过10(85)倍)，将其移植到先天性不孕的受体小鼠的生精小管，仍能使其恢复生育力，并产生有正常生育力的后代【11】。这些特性将使精原干细胞成为有潜力的种质资源。 

通过退分化诱导精原干细胞能够产生多能干细胞，用于组织器官康复临床医疗的研究及应用【12，13，14】。精原干细胞及其衍生的多能干细胞在再生医疗方面将有大的作为。也许在不久的将来，男士们就可以通过自己睾丸的一个小小的切片来治愈自身的疾病【15】。 

可见精原干细胞在生殖生物学研究、转基因动物技术研究、退分化诱导产生多能干细胞研究、动物种质资源保存研究及组织器官康复临床医疗研究上具有重要意义。精原干细胞培养技术的建立，对多个学科的研究和应用有促进作用。但是，家畜精原干细胞的长期培养至今仍然是世界难题。精原干细胞研究最著名的专家Brinster带领的研究组2008年曾经发表论文说过大动物精原干细胞长期培养方法的建立还需要5至10年的研究【16】。虽然鼠类的精原干细胞长期培养方法已经建立，种族差别、基因库差别、市售抗体不能通用等多种因素的存在，家畜精原干细胞的长期培养方法不能照搬鼠类的方法。鉴于家畜精原干细胞长期培养技术意义重大，不仅具有理论价值，在农牧业和医 学上还具有经济应用价值和社会价值【1】，美、欧、日、澳、韩等国均有科研组织致力于家畜精原干细胞长期培养的研究，曾有家畜精原干细胞的纯化、鉴定方面的报道，但是家畜精原干细胞的长期培养还没有成功。国内西北农林科技大学张涌团队在牛精原干细胞分离纯化方面取得了一定的成果【17】。但是，至今还没有看到完整的家畜精原干细胞长期纯化培养方法、分子水平特异鉴定及遗传修饰的报道。