[发明专利]一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法

权利要求书

1.一种极耐热糖苷酶基因，其特征在于，该极耐热糖苷酶基因的获取过程为：参照NCBI上已发表的T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶的基因序列设计引物，登录号：YP_004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得极耐热糖苷酶基因全序列；

该极耐热糖苷酶基因克隆到pET-28a载体，可得到包含极耐热糖苷酶基因核苷酸序列的重组质粒pET-28a-bgl。

2.如权利要求1所述的极耐热糖苷酶基因，其特征在于，所述重组质粒pET-28a-bgl的制备方法为：

步骤一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到极耐热糖苷酶基因的PCR扩增产物，引物为：

P1：CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCTTCGGCGTGGC

GTAAGTTGAAATGGGATATG，下划线表示Nco I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；

P2：CCCCTCGAGCATCATCGTAGTTGGTAGTTGTG

AAAGCCGTTGTCCCTTCTTTG，下划线表示Xho I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；

步骤二，将步骤一所得PCR扩增产物和pET-28a分别用Nco I和Xho I双酶切，并分别割胶回收，16℃过夜连接；

将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；

挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-bgl。

3.如权利要求1所述的极耐热糖苷酶基因，其特征在于，极耐热糖苷酶的可溶性表达的实现方法为：

将重组质粒pET-28a-bgl转化大肠杆菌JM109(DE3)，挑单菌落到摇瓶培养基，培养和诱导的温度为37℃，不加入诱导剂IPTG，12h后收集细胞，超声波破细胞，并利用Ni亲和层析柱进行重组酶的纯化，最终得到极耐糖苷酶的纯酶。

4.如权利要求1所述的极耐热糖苷酶基因，其特征在于，极耐热糖苷酶的定性为：在95℃、pH 4.8的条件下酶活最高，该酶在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L。

5.权利要求1所述的极耐热糖苷酶在转化人参皂苷Rb1为Rd中的应用，其特征在于，该极耐热糖苷酶应用于对人参皂苷Rb1的转化时，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min，可将99％人参皂苷Rb1转化为Rd。