[发明专利]一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及甲壳类免疫器官中表达的基因序列，具体涉及一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子的基因序列及其用途。

背景技术

甲壳类动物免疫包括细胞免疫和体液免疫两种方式。细胞免疫包括吞噬作用、包围化及结节的形成；体液免疫系统包括粉氧化酶原激活系统、各种凝集素及抗菌肽等。

巨噬细胞移动抑制因子最早是在1966年研究迟发型超敏反应的时候发现的一种分子，它具有多种生物活性，既是一种细胞因子，又是一种源于垂体的激素，还可以作为糖皮质激素生理活动的负反馈调节剂。在脊椎动物体免疫体统方面，巨噬细胞移动抑制因子参与迟发型超敏反应、刺激T细胞增殖，并在自身免疫系统疾病中参与作用。另外，巨噬细胞移动抑制因子还能促进肿瘤细胞生长。

拟穴青蟹是四种青蟹之一，属节肢动物门，甲壳纲，十足目，爬行亚纲，短尾派，梭子蟹科。具有很高的营养价值、药用价值和工业价值，是我国三大经济蟹类之一。近年来，随着养殖规模的不断扩大，在养殖过程中，由于水质、苗种质量以及细菌感染等原因容易导致青蟹的大量死亡。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子的基因序列及其用途。该基因的获得不仅为研究甲壳类巨噬细胞移动抑制因子在免疫反应中的作用机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的蛋白产物，为进一步研究MIF的免疫功能提供理论基础；该基因还可以用于拟穴青蟹的抗病相关研究。

本发明提供了从拟穴青蟹肝胰腺SMART cDNA文库中筛选出的一个巨噬细胞移动抑制因子的核苷酸序列、氨基酸序列及其时空表达图谱以及在拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵产品中的应用。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF，它所编码的蛋白质具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明所述的拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF是从拟穴青蟹肝胰腺的SMARTcDNA质粒文库中筛选到的一个基因。该基因cDNA长734bp，自99bp到461bp区段为其开放阅读框，编码120个氨基酸。

拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF ORF的核苷酸克隆方法，其中，所涉及的引物序列如下：

上游引物：5’-CCGAAGAACCTCACTCCA-3’，

下游引物：5’-CAGCCGACAATCGAAATAT-3’。

本发明还提供一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF转录水平的检测方法，其中，所述的检测方法为使用一对荧光定量PCR引物进行PCR检测，所述的一对荧光定量PCR引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的引物如下：

上游引物：5’-CGAACCTGCCCAAGGAGAA-3’，

下游引物：5’-ACTGGTGCCGCCGAAAG-3’。

本发明还提供了上述的一种拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子基因MIF在制备拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵产品中的应用，其中，所述的病原微生物为副溶血性弧菌。

本发明利用荧光定量PCR技术检测了MIF在拟穴青蟹的血细胞、肝胰腺、心脏、精巢、心脏、鳃中的转录水平，结果表明：该基因在所检测的六个组织中均有mRNA存在，其中在肝胰腺中的丰度最高，其次在血细胞和鳃中。另外还检测到经副溶血性弧菌刺激后的血细胞中的MIF基因表达量呈上升趋势，明显较正常水平高，这显示该基因在拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。

有益效果

本发明的基因的获得不仅为研究甲壳类巨噬细胞移动抑制因子在免疫反应中的作用机理奠定了基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的蛋白产物，为进一步研究MIF的免疫功能提供理论基础。此外，本发明的基因还可以用于拟穴青蟹的抗病相关研究。

附图说明

图1是采用TaKaRa rTaq扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是荧光定量检测MIF在拟穴青蟹六个组织中的表达情况；