[发明专利]一种促进植酸酶在毕赤酵母中表达的载体无效

专利信息
申请号: 201210550026.4 申请日: 2012-12-17
公开(公告)号: CN103088052A 公开(公告)日: 2013-05-08
发明(设计)人: 黄亦钧;程斯达;康丽华;王华明;许丽红;刘艳萍;吴秀秀 申请(专利权)人: 青岛蔚蓝生物集团有限公司
主分类号: C12N15/81 分类号: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/31;C07K14/39;C12R1/84
代理公司: 青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201 代理人: 曾庆国
地址: 266061 山东省青岛市*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 促进 植酸酶 酵母 表达 载体
【说明书】:

技术领域

发明涉及微生物工程技术领域,具体涉及一种含翻译调控因子Hac1的表达载体及含有该载体的毕赤酵母工程菌。 

背景技术

蛋白质的异源表达是常用分子生物学领域研究的重点之一;特别是对于工业化生产而言,超水平表达是提高生产效率和节省成本的关键手段之一。蛋白质异源表达的宿主很多,有原核微生物,如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等;也有真核微生物,如毕赤酵母和里氏木霉等。原核生物具有代时短,生长快的优点;但是去缺乏胞内翻译后修饰系统。因此,原核生物的异源表达蛋白往往没有活性,或者说表达水平很低(张小霞等,2004,国外医学卫生学分册)。而真核微生物具有翻译后修饰系统,同时往往又具有分泌表达和高密度发酵的优势;因此,越来越多的真核微生物被开发来应用于生产工业酶和食品酶等。无论是学术研究还是规模化工业生产,毕赤酵母(Pichia pastoris)是最常用的真核表达系统之一(Porro等,2005,Mol. Biotechnol.)。 

但是,毕赤酵母的蛋白质表达水平非常低,多数工程菌胞外分泌的目的蛋白含量约为8g/L(Niebaur等,2005,Protein expression technologies)。有很多因素影响蛋白质表达水平,如启动子,拷贝数,信号肽、密码偏爱性,翻译修饰和发酵工艺等(Payne等 2008,Appl. Environ. Microbiol.)。但是,研究发现毕赤酵母胞内的很多促进蛋白质折叠,囊泡运输和跨膜运输的因子能显著提高蛋白质的表达水平。 

只有正确折叠的蛋白质才能运输到胞外。如果外源蛋白翻译后不能正确折叠,则会引起蛋白非正确反应,简称UPR反应(unfolded protein response,简称 UPR)。UPR会抑制转录和反应;同时促进错误折叠蛋白质的降解,从而影响蛋白质表达水平(Alimjan,2010,Appl Microbiol Biotechnol)。UPR反应能调控胞内很多与蛋白表达相关因子的表达,如分子伴侣,折叠酶、囊泡运输相关的激酶和转录因子Hac1P等(Mouna,2010,Microbial Cell Factories ),其中Hac1P能促进蛋白质表达(Saloheimo,2003, Mol.Microbiol)。Hac1P的表达是受到UPR严格调控的。Hac1-mRNA是组成型表达的,但是其内部含有1个内含子;只有内含子被剪切后,Hac1-mRNA才能正确表达。 

发明内容

本发明的目的是提供一种含翻译调控因子Hac1的表达载体,并通过将该表达载体导入产外源植酸酶的毕赤酵母工程菌,构建得到新的工程菌。所述工程 菌中外源植酸酶的表达水平得到了显著提高,具有广泛的应用前景。 

本发明一方面提供一种用于表达翻译调控因子Hac1基因的真核表达载体。 

上述翻译调控因子Hac1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。 

上述翻译调控因子Hac1基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。 

上述表达载体为毕赤酵母表达质粒pGAPZ。 

本发明还提供一种提高植酸酶在毕赤酵母工程菌中表达的方法,是将上述的表达载体转入表达植酸酶的毕赤酵母工程菌中,形成新的重组工程菌。 

上述的重组工程菌为毕赤酵母SDLH-1(Pichia pastoris SDLH-1),已于2012年12月5日保藏于位于武汉珞珈山武汉大学的“中国典型培养物保藏中心”,保藏号为CCTCC NO:M 2012503。 

本发明还提供了上述毕赤酵母工程菌SDLH-1的应用,用于高效表达外源植酸酶。 

本发明构建了一个表达翻译调控因子Hac1基因的表达载体,同时将该载体导入产植酸酶的毕赤酵母工程菌,得到新的工程菌。该工程菌表达植酸酶的水平得到显著提高,表达量提高17%以上。 

附图说明

图1:本发明构建的用于表达翻译调控因子Hac1基因的真核表达载体的质粒遗传图谱。 

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容,本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是,本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。 

实施例1: Hac1基因的克隆 

1.1总DNA的提取 

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