[发明专利]在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法

权利要求书

1.一种含有编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，其特征在于，包括诱导型启动子、位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为pPICZαA。

4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，在编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列的5’端连接有XhoI酶切位点，且在XhoI酶切位点的5’端连接有保护碱基CCG；在编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端连接有XhaI酶切位点，且在XhaI酶切位点的3’端连接有保护碱基GC。

5.含有权利要求1-4任一项所述表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其为毕赤酵母。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其为毕赤酵母X-33基因工程菌。

8.权利要求7所述基因工程菌的培养方法，包括以下步骤：

1）种子液的制备：从YPD平板挑取酵母转化子单菌落，接种于含100μg/ml zeocin的10ml YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养18-24h，以1%接种量接种于200ml YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养16-18h，至OD_600nm值为6，即得种子液；

2）发酵培养：25℃~29℃下，按10%的接种量将上述种子液加入2L基础盐培养基中，调pH值至5.0，加入9.6ml PMT1，通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；

3）饲喂碳源：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加含12‰PMT1的50%葡萄糖溶液，流加速度为12~24ml/L/min，连续流加6~8h，转速上调至1000rpm；

4）甲醇诱导：流加葡萄糖后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速1ml/L/min逐渐增加到第六小时的6ml/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调至5.5，控制溶氧在20%以上，至发酵结束；

其中，步骤2）中使用的基础盐培养基配方为：45g葡萄糖、50gNH₄H₂PO₄、20g K₂SO₄、15g MgSO₄7H₂O、6g KH₂PO₄、0.4g CaSO₄和1.5g KOH，加水定容至1L。

9.一种在重组毕赤酵母中表达抗菌肽NZ2114的方法，其是利用权利要求1-4任一项所述的表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽NZ2114。

10.重组毕赤酵母菌（Pichia pastoris）X-33/NZ2114，其保藏编号为CGMCC No.6987。