[发明专利]薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的植物过量表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及薄荷柠檬烯合酶基因MhLS及其植物过量表达载体的具体构建方法和应用。

背景技术

薄荷属植物不仅是全世界重要的药用植物之一，也是仅次于橘类的第二大香料植物。薄荷油是薄荷的主要化学成分，在食品、制药、香料、化妆品工业上具有大量用途。

单萜是薄荷挥发油主要成分。单萜是由两个异戊二烯结构单元组成的C10类萜类化合物及其衍生物。单萜类化合物在抵抗微生物病原菌、防御昆虫和植食性动物方面有着重要的作用，在吸引昆虫传粉和植物种群竞争中也很重要(Pichersky and Gershenzon，2002)。薄荷挥发油合成途径被视为是植物单萜合成途径的典型模式(Jonathan et al.，2000)。挥发油最主要的成分薄荷脑的形成需要经过很多步反应，包括一系列不同类型的生化反应(Kjonaas and Croteau，1983；Kjonaas et al.，1985；Croteau andVenkatachalam，1986)。同时，催化每个反应的酶也都已经被阐明(Kjonaas et al.，1982，1985；Croteau andVenkatachalam，1986；Karp et al.，1990；Croteau et al.，1991；Alonso et al.，1992；Rajaonarivony et al.，1992；Colby et al.，1993)。

柠檬烯是最简单的环形单萜，广泛存在于植物挥发油中，如薄荷属、柑橘属、松科、伞形科植物等(Guenther，1972)。  在薄荷中，柠檬烯是薄荷挥发油合成前提，不论在是薄荷酮化学型薄荷或在香芹酮化学型薄荷。柠檬烯合酶催化GPP环化为柠檬烯(Kjonas and Croteau，1983)，该反应决定薄荷油合成途径的整体反应速率(Gershenzon and Croteau，1991)。柠檬烯合酶是最典型的被子植物单萜环化酶。该酶大小为65 kDa，pI值大约为5.0，最佳反应pH为7.0左右。柠檬烯合酶需要与二价金属离子(如Mg2+或Mn2+)才能与底物结合并催化反应。此酶可以识别香叶基作为它的底物，还对半胱氨酸残基、甲硫氨酸残基、组氨基酸残基等较为敏感(David et al.，2007)。

农杆菌介导法是应用最广泛的植物遗传转化方法。将薄荷柠檬烯合酶基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导法进行植物遗传转化，可以获得单萜含量提高的新种质。对于薄荷新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供薄荷单萜合成途径中的关键调控酶-柠檬烯合酶的基因序列，使得可以对薄荷单萜合成途径进行调控和改造，提高目的产物的产量。

本发明同时提供了该基因的植物过量表达载体及其构建方法。所构建的植物表达载体可以用于农杆菌介导的遗传转化，创造新的薄荷品质资源，可用于薄荷品种改良。

附图说明

图1薄荷MhLS基因的PCR扩增结果

图2薄荷MhLS基因植物表达载体构建双酶切过程

图3重组菌液PCR检测结果

图4重组质粒酶切验证

具体实施方式

实施例1薄荷柠檬烯合酶基因的克隆

从GenBank中查找柠檬烯合酶基因的cDNA序列，并设计引物序列如下：

上游引物5’-GAAAGAGAGCGGAAGGAAAGATT

下游引物5’-AGAATTACGTACGAACTATGCCTT

以薄荷第一链cDNA为模版扩增，得到MhLS基因的全长cDNA序列。