[发明专利]酿酒酵母表达载体及其构建和应用

说明书

本发明公开了一种酿酒酵母表达载体及其构建和应用。所述酿酒酵母表达载体是通过在pYF1274质粒的BamHI和SacI酶切位点之间插入含有生物法合成丁醇用的6关键酶基因的融合基因编码序列构建而成的。通过将该酿酒酵母表达载体转化的酿酒酵母生物法生产丁醇，产量达到1.556g/L，这为通过基因工程手段生产生物丁醇提供了有益的帮助。

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一种酿酒酵母表达载体及其构建和应用，具体涉及一种含有生物法合成丁醇用的6关键酶基因的酿酒酵母表达载体及其构建，和将此表达载体转化到酿酒酵母中发酵生物法合成丁醇的应用。

背景技术

丁醇是一种重要的有机化工原料，它是多种涂料的溶剂和制造增塑剂和酯类的原料，同时也是继乙醇后的一种极具发展前景的能源物质，有着十分广泛的用途。丁醇和乙醇相似，但丁醇在燃料性能和经济性方面比乙醇有着明显的优势：1）汽油中的主要成分是C₅-C₁₂，因此丁醇与汽油的配伍性更好；2）丁醇具有较高的能量密度，具有较好的燃料经济性；3）丁醇亲水性弱，能与汽油任意比例混合，腐蚀性小，便于管道输送。

目前工业上生产丁醇主要有3种方法：1）羰基合成法；2）醇醛缩合法；3）发酵法。前两种方法属于化学法，是以石油为原料，投资大，技术设备要求高。而微生物发酵法的原料价廉，来源广泛，选择性好，副产物少，安全无污染。随着石油储量的减少和价格持续上涨，加上石油化工造成的环境污染问题，促使人们认识到丁醇发酵的重要性。从长远的利益出发，应用微生物发酵法来获得生物丁醇是最经济、有效、无污染的根本措施。

目前国内外报道的用于微生物发酵产丁醇的宿主菌株多采用拜氏梭（Beijerinckii）和丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）或其突变株。这些菌株呈现出较强的淀粉酶活力，适用于发酵玉米和谷类等淀粉质原料，导致用于发酵的原料成本偏高。此外，由于受到丁醇的毒害作用，这些菌株发酵所获得的丁醇产量和产率低。这也成为制约丁醇生物生产的主要瓶颈所在。

伴随着代谢工程、基因工程技术的迅速发展和C.acetobutylicum ATCC 824基因组测序的完成，构建高转化率，遗传稳定的基因工程菌种生产生物丁醇已成为研究热点。例如通过基因阻断技术，解除代谢过程中存在的产物和中间产物，构建了高丁醇比菌株。此外，许多学者还通过基因工程技术成功将丁醇合成途径导入大肠杆菌、酿酒酵母、短乳杆菌、恶臭假单胞菌和枯草芽孢杆菌等中用于生物丁醇的合成。虽然上述菌株发酵后都能够获得丁醇，证明了由非自然宿主生产丁醇是可行的，但产量都是微量的。所以如何应用基因工程技术，从丁醇合成途径水平上出发，通过切断代谢过程中存在的产物（乙醇和丙酮）和/或组合丁醇合成途径中的关键酶来构建高产丁醇的工程菌种，这对于提高微生物发酵生物丁醇的产量和产率具有重要的理论意义。

由于酿酒酵母作为工业菌株生产乙醇的巨大成功，因而吸引了许多学者通过构建酿酒酵母工程菌株来生产与乙醇仅有两个碳原子差异的生物丁醇。然而目前所报道过的在酿酒酵母中构建不同来源的生物丁醇合成途径的关键基因，工程菌发酵后丁醇的产量最高仅为2.5mg/L。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种酿酒酵母表达载体，即通过选择不同来源于生物法合成丁醇用的6关键酶基因来构建表达载体从而提高酿酒酵母发酵生物法合成丁醇的产量。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种所述酿酒酵母表达载体的构建方法。

本发明所要解决的技术问题之三在于提供所述酿酒酵母表达载体在生物法合成丁醇过程中的应用。

本发明所述的酿酒酵母表达载体，是在pYF1274质粒的BamHI和SacI酶切位点之间插入生物法合成丁醇用的6关键酶基因的融合基因编码序列，从而构建而成的，命名为pYF1274-Buta(syn)O。