[发明专利]猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，主要应用于猪圆环病毒2型抗体水平的检测，由此来判断猪场中猪圆环病毒2型的感染情况以及疫苗的免疫效果。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)为无囊膜的单股环状DNA病毒，病毒粒子直径约17nm～20nm，是迄今已知最小的动物病毒之一。PCV2与其它病原混合感染以及其它应激因子存在，会诱发猪圆环病毒病的发生，这些疾病主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪繁殖与呼吸综合征、新生仔猪先天性震颤、猪呼吸道病综合征、猪增生性和坏死性肺炎等，其中以PMWS最为严重。PMWS主要引起6～12周龄仔猪渐进性消瘦、呼吸道症状、皮肤苍白或出现黄疸、腹泻，造成患猪免疫机能下降、生产性能降低。PCV2在淋巴系统增殖，可引起免疫细胞的凋亡，造成免疫抑制，从而易发生混合感染和继发感染，多种病原混合感染和继发感染层出不穷，从而导致猪病临床症状和病理变化复杂化，给猪场疫病防治带来困。目前国内外猪场普遍存在PCV2，现已对全球养猪业构成重大危害。PCV2有三个主要的开放阅读框，分别为ORF1、ORF2和ORF3。ORF1编码与病毒复制相关的蛋白Rep和Rep’；ORF2编码病毒的主要免疫原性衣壳蛋白；ORF3编码毒力相关蛋白，通过诱导细胞凋亡在病毒的致病过程中发挥重要作用。PCV2-ORF2有705个碱基，编码的衣壳蛋白为病毒的结构蛋白，分子量为30Ku，具有较好的免疫原性，且该蛋白在PCV1、PCV2之间的同源性只有67％。虽然PCV1-0RF2与PCV2-ORF2抗原性相关，但只有ORF2蛋白可以被PCV2多抗识别，这为建立特异检测PCV2的血清学方法奠定了基础。

目前，PCV2的实验室诊断方法主要有病理组织学检测、病毒的分离与鉴定、间接免疫荧光技术、免疫组化技术、PCR技术等，但这些技术对试验条件和专业技能要求较高，并且操作过程比较繁琐，不适合于兽医临床快速检测和大规模检测的需要。而酶联免疫吸附试验(ELISA)方法具有操作简便、快速、灵敏度高的特点，尽管国内外已经有一些猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，但多采用间接ELISA的方法，且包被抗原与抗体结合性能较差，非特异性反应较多。本发明的抗体检测板所包被的Cap蛋白为PCV2的真核表达核衣壳蛋白，同时使用该Cap蛋白偶联的酶标抗原，使非特异性反应大为减少，极大地提高了抗体检测的灵敏度和准确度，完全适用于大规模检测的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，本发明采用双抗原夹心ELISA方法，抗体检测板所被的抗原为真核表达的Cap蛋白，具有更好的抗原空间结构，灵敏度更高，由该Cap蛋白标记的酶标抗原与样品中抗体结合的特异性会更强，这些都是普通ELISA试剂盒所不具备的优点。

本发明的技术方案为：一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包含有：

抗体检测板：所述抗体检测板包被抗原的制备是以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对特异性引物，上游引物：5’-GTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGC-3’；下游引物：5’-GTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT-3’，在两条引物的5’端分别加入FokI和SalI酶切位点，以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因，通过设计的FokI/SalI双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP-secSUMO3中，转入大肠杆菌JM109，用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP-secSUMO3-Cap，其中的阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115，Zeocin浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌，最后将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后制得的。将制备的Cap蛋白加入到0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液中进行稀释，以每孔包被浓度为1ug/ml的量分别加入96孔抗体检测板中，4℃包被过夜，用含体积浓度0.05％吐温-20的pH7.4的1mol/L PBS溶液洗涤三次，再用质量分数为5％的脱脂奶粉在37℃下封闭2小时，用以上PBS溶液洗涤三次，在室温下风干。