[发明专利]一种棕榈酸辅酶A的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶的制备方法,尤其涉及一种采用发酵方式制备棕榈酸辅酶A的方法,属于棕榈酸辅酶A的制备领域。

背景技术

棕榈酸辅酶A是棕榈酸与辅酶A合成的产物，可以用于生物化学等多重领域。现有的棕榈酸辅酶A的生产方法主要有化学合成法与酶转化法。化学合成法存在合成步骤多收率低等缺点，酶转化法需要用到辅酶A（CoA）、ATP，因为辅酶A（CoA）、ATP价格昂贵，故棕榈酸辅酶A的酶转化法的成本很高，有待改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有酶转化法制备棕榈酸辅酶A的所存在的成本高的缺陷，提供一种成本较低的制备棕榈酸辅酶A的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种制备棕榈酸辅酶A的方法，包括以下步骤：

（1）克隆编码乙酰辅酶A合成酶的基因并将其转化到大肠杆菌细胞中进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；

（2）将步骤（1）的基因工程菌株种子接入发酵初始培养基进行初始培养直至初始培养基中营养耗尽，溶氧上升至50%以上；

（3）初始培养结束后，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；

（4）诱导培养结束后加入十二烷基磺酸钠(SDS)至其终浓度为0.05～0.15g/L，进行预转化培养；预转化培养完成后流加转化补料培养基继续进行转化培养，得到棕榈酸辅酶A。

其中，步骤（1）中从施氏假单胞菌（ATCC 17588）中克隆得到编码乙酰辅酶A合成酶的基因，将此基因在大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；所述的编码乙酰辅酶A合成酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

步骤（2）中所述的发酵初始培养基组成包括：磷酸氢二铵6-12g/L、磷酸二氢钾3-6g/L、一水柠檬酸0.2-1g/L、硫酸镁 0.3-2 g/L、微量元素母液1-3ml/L、葡萄糖10-20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L；2M硫酸与氨水做为酸碱调节pH值为6.5-7.3；

所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到：（1）按以下用量称取各成分：10g FeSO₄．7H₂O，2.25g ZnSO₄.7H₂O，1g CuSO₄.5H₂O，0.5gMnSO4.5H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇.10H₂O，2g CaCl₂.2H₂O，0.1g (NH₄)₆Mo₇O₂₄；（2）将上述各成分溶于1L 5M盐酸中，即得。

步骤（3）中初始培养结束后降温至28℃，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；

所述的诱导补料培养基的组成为：甘油200-400g/L 、乳糖70 -130g/L，硫酸铵100-200g/L；pH值为4.5。

步骤（3）中当菌液OD600的值为40-50，酶活为20KU/L时停止诱导培养转入转化培养阶段。

步骤（4）中所述的预转化培养的培养条件包括：通气量为0.5L/L发酵液/min，转速为200～300rpm，温度保持在28℃；使用2M硫酸和氢氧化钠调节pH值为6.1～6.3；

步骤（4）中预转化培养30min后开始流加转化补料培养基；

所述的转化补料培养基的组成成分包括：甘油50-150 g/L，棕榈酸钠 100-300g/L；

所述的流加转化补料培养基的方式包括：流加速度初始时设定为1ml/h/L发酵液，1h后调整为3ml/h/L发酵液，1.5h后调整为5ml/h/L发酵液，2h后调整为7ml/h/L发酵液，保持此流速。

步骤（4）的补料过程中，通过调整通气量将溶解氧含量控制在30%左右。