[发明专利]抗C肽单克隆抗体及其在检测C肽含量中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体,尤其涉及配对的抗C肽单克隆抗体以及分泌该抗C肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株,本发明进一步涉及它们在制备检测或诊断C肽的试剂或药物中的用途,属于C肽的检测或诊断领域。

背景技术

C肽（C-Peptide）又称连接肽，是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体——胰岛素原。一个分子的胰岛素原经酶切后，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C肽。测定C肽能得知胰岛细胞的功能，对糖尿病的诊断和治疗具有很大的意义，C肽没有胰岛素的功能，而胰岛β细胞分泌的胰岛素和C肽呈等分子关系，这也就是说，分泌几个胰岛素分子，同时必然分泌几个C肽分子。血中C肽浓度可间接反应胰岛素浓度。C肽不受肝脏酶灭活，半衰期比胰岛素长，经肾脏直接在尿中排泄，故血中C肽的浓度可更好地反映胰岛的功能。C肽的清除主要通过肾脏降解和排泄，C肽在尿中的浓度高于血浆中的浓度。治疗用的胰岛素不含C肽，因此，C肽不受外源性胰岛素的影响，这是在研究胰岛β细胞功能方面比胰岛素优越之处。C肽释放试验在某种意义上可代替胰岛素释放试验，可用于正接受胰岛素治疗的患者，C肽浓度的测定是诊断和理解糖尿病临床状况的有用指标。

C肽由31个氨基酸残基构成，分子较小，通过多肽合成的方式得到的C肽稳定性很差，容易降解，无论做为免疫抗原或筛选抗原均不合适。

发明内容

本发明的目的之一是提供相互配对的两种抗C肽单克隆抗体;

本发明的目的之二是提供分泌所述抗C肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株;

本发明目的之三是将所述的抗C肽单克隆抗体应用于诊断或检测C肽;

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:

本发明采用C肽-GST做免疫原，C肽-Trx做为筛选抗原，筛选获得2株杂交瘤细胞株，3G1和5F7；采用C肽-Trx做免疫原，C肽-GST做为筛选抗原，筛选获得3株杂交瘤细胞株，2A9，5C8和5B12。

本发明通过进一步的试验发现采用C肽-GST做免疫原筛选得到的杂交瘤细胞株5F7所分泌的单克隆抗体和采用C肽-Trx做免疫原筛选得到的杂交瘤细胞株5B12所分泌的单克隆抗体，二者之间能够相互配对，作为一对配对的单抗克隆抗体，通过双抗夹心ELISA法应用于检测C肽，检测结果具有较高的准确性和灵敏度。

本发明将杂交瘤细胞株5F7提交专利认可的机构进行保藏；其微生物保藏编号为：CGMCC NO.6804；保藏时间为：2012年 11月9 日；其分类命名为：C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将杂交瘤细胞株5B12提交专利认可的机构进行保藏；其微生物保藏编号为：CGMCC NO.6805；保藏时间为：2012年 11月 9日；其分类命名为：C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明采用大肠杆菌表达的带有两种不同标签的C肽融合蛋白，解决C肽分子量小、不稳定的问题。采用两种融合蛋白分别做为抗原，免疫小鼠，采用两种抗原交叉进行筛选，既避免了得到抗标签的单抗，又增加了得到抗不同表位单抗的机会，从而增加了可用于夹心法检测C肽的配对单抗的机会。

对于一种稳定性差的多肽C肽，采用两种不同标签，表达两种带有目的蛋白的融合蛋白，经已有的免疫学反应检测，可以与已有的特异性抗体反应；采用其中一种融合蛋白做为免疫原，用另外一种融合蛋白做为筛选用抗原，获得单克隆抗体，并进行配对实验。由于表达融合蛋白的分子伴侣不同，蛋白的构象可能有所差异，从而可能得到针对不同表位的单抗，使配对成功的机会增加。

本发明通过表达两种不同标签的融合蛋白分别用于免疫和检测，使得到配对单抗的几率增加，进而得到了抗不同表位的能力，从而增强了检测C肽的敏感性和准确性。本发明与现有技术相比，本发明将得到的两种带有标签的融合蛋白作为免疫原，由于不同标签融合蛋白的蛋白构象不同，其增加了抗不同表位抗体产生的机会；以带有与免疫原不同标签的融合蛋白作为筛选抗原，避免了C肽不稳定造成的筛选结果不稳定。同时,使用GST和Trx作为标签，可增加蛋白的可溶性及稳定性，且便于纯化。

附图说明

图1 为制备配对抗体的流程图。

图2 为以5F7/5B12作为配对抗体进行双抗夹心ELISA检测C肽的结果。

具体实施方式