[发明专利]一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法，属于分析化学领域。

背景技术

细胞分裂素(cytokinins,CKs)是一类腺嘌呤衍生物，根据N-7位上的取代基的不同分为异戊烯基腺嘌呤和芳香基腺嘌呤。在植物体内，细胞分裂素以自由碱，细胞分裂素核苷、核苷酸和细胞分裂素糖苷形式存在，现已被发现的细胞分裂素有四十多种。细胞分裂素在植物体整个生命中起着重要的调节作用，包括细胞的分裂与分化，根、芽的形成与生长、损伤后的再生，消除顶端优势等。近年来，关于细胞分裂素的生理学机能，例如CKs的生物合成、降解、代谢路径以及与其他激素之间的相互作用的研究收到广泛关注。但由于植物的提取液中基质复杂且细胞分裂素的含量低，这些研究的开展受到一定限制。因此，建立高效的样品前处理方法并结合高灵敏度的检测方法是CKs检测的关键。

目前，已报道的植物中细胞分裂素的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、磁固相萃取和液相色谱纯化方法等。较其他方法相比，固相萃取因具有操作简便，可选商品化的填料种类多而被广泛使用。但是，这些方法一般是多步或多层不同性质（反相型、离子交换型和混合模式型）的填料的组合，操作过程繁琐，且细胞分裂素在实际样品中的回收率低，消耗的植物样品量多（一般需要200毫克），且在处理过程中用到多种不同种类的溶剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单、快速的植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法。

本发明为解决上述技术问题所提出的技术方案为：一种植物样品中内源性细胞分裂素的定量检测方法，包括以下步骤：

1）提取内源性细胞分裂素：准确称量植物样品后用液氮冷冻，研磨至粉末状，加入同位素内标[²H₆]异戊烯基腺嘌呤，[²H₆]异戊烯基腺嘌呤核苷，[²H₆]异戊烯基腺嘌呤9-糖苷，[²H₅]反式玉米素，[²H₅]反式玉米素核苷，[²H₅]反式玉米素9-糖苷，[²H₃]二氢玉米素，[²H₃]二氢玉米素核苷，然后加入乙腈，-20℃以下放置12小时以上；

2）除固体：将步骤1）所得样品离心，取上清液；

3）固相萃取除杂：将步骤2）所得的上清液通过事先用平衡液平衡后的固相萃取小柱，清洗后收集解吸液，除去收集到的解吸液中的溶剂；

4）定容检测：将步骤3）所得样品定容后进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，检测细胞分裂素。

所述的固相萃取小柱填料为亲水性填料。作为一种优选，所述的固相萃取小柱填料为硅胶。

本发明所述的植物样品包括：水稻、油菜、拟南芥、番茄、烟叶等植物的根、茎、叶、花、花粉等组织及其组织提取液。

细胞分裂素是一类腺嘌呤的衍生物，其结构中均含氮原子的杂环或糖苷键，赋予其一定的亲水性。因此，我们利用亲水作用来富集纯化细胞分裂素。在固相萃取步骤中，硅胶是廉价易得的吸附剂，利用亲水作用富集提取液中的细胞分裂素，再通过清洗步骤，除去非极性杂质（非极性色素等）。此外，植物基质中的极性基质在分离过程中最先出来，实现杂质与目标的细胞分裂素的分离。

本发明利用亲水作用通过固相萃取柱（硅胶）可以有效地富集细胞分裂素，除去非极性杂质，需要的样品量少，操作简单，实现快速的细胞分裂素检测方法，使细胞分裂素在实际样品中有较高的回收率，仅在20mg植物叶片和根中实现了内源性细胞分裂素的检测。

附图说明

图1是应用本发明所提供的8种细胞分裂素标准样品的多反应监测谱图，其中，1为反式玉米素9-糖苷(t-Z9G)，2为反式玉米素(t-Z)，3为二氢玉米素(DHZ)，4为反式玉米素核苷(t-ZR)，5为二氢玉米素核苷(DHZR)，6为异戊烯基腺嘌呤9-糖苷(iP9G)，7为异戊烯基腺嘌呤(iP)，8为异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)。

图2为检测到的水稻叶中内源性细胞分裂素多反应监测谱图，其中，1为反式玉米素9-糖苷(t-Z9G)，2为反式玉米素(t-Z)，3为二氢玉米素(DHZ)，4为反式玉米素核苷(t-ZR)，6为异戊烯基腺嘌呤9-糖苷(iP9G)，7为异戊烯基腺嘌呤(iP)，8为异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)。