[发明专利]一种利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法

权利要求书

1.一种利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、在单链抗体基因的5′端，或者3′端，或者是在柔链区引入编码寡糖转移酶识别序列：D/E-X-N-X-S/T；将重组后的单链抗体基因连接到原核质周腔表达载体；

其中，D代表天冬氨酸，E代表谷氨酸，N代表天冬酰胺，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表天然20中氨基酸中的任意一种氨基酸；

S2、将所述表达载体转化到含有来源于空肠杆菌由氯霉素抗性标记的pgl基因族工程菌株CLM37，然后，将阳性转化子进行自诱导表达；

S3、收集菌体，提取质周腔可溶蛋白，分离纯化糖基化单链抗体；

S4、用高碘酸钠氧化糖基化单链抗体后，用醋酸钠缓冲液透析去掉高碘酸钠后，将单链抗体通过氧化糖链产生的醛基固定在带有酰肼基团或氨基基团的固体材料表面，实现以共价键定向固定单链抗体在固体材料表面。

2.根据权利要求1所述利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法，其特征在于，所述单链抗体为4M5.3。

3.根据权利要求2所述利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法，其特征在于，步骤S2的自诱导表达过程包括：

将所述阳性转化子接种到LB培养基中，250rpm、37℃培养，直至OD600达到0.4~0.6，5000rpm离心，弃掉培养基，添加相同体积的ZYP-5052丰富培养基，250rpm、20~30℃培养，进行自动诱导表达18至24小时。

所述LB培养基中含有氨苄青霉素和氯霉素，终浓度分别为200和64微克每毫升；

所述ZYP-5052培养基的配制包括如下步骤：

A、先配制ZY培养基925毫升，含10克蛋白胨,5克酵母提取物；

20×NPS储备液，其中，1升蒸馏水中含66克（NH₄）₂SO₄，136克KH₂PO₄，142克NaHPO₄；

50×5052储备液，其中，1升含有250克甘油，25克葡萄糖，100克α-乳糖；

1摩尔MgSO₄；高压灭菌15分钟；

B、500毫升自动诱导培养基中含有464毫升所述ZY培养基，0.5毫升1摩尔MgSO₄，10毫升50×5052，25毫升20×NPS。

4.根据权利要求1-3任一所述利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法，其特征在于，步骤S4的具体过程为：在0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液中经10毫摩尔高碘酸钠氧化，用0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液透析去掉高碘酸钠；将氧化过的单链抗体直接与含有酰肼基团或氨基基团的固体在室温共孵育1小时，然后用pH7.4的磷酸缓冲液冲洗，完成单链抗体通过糖链标签定向固定在固体表面。

5.根据权利要求4所述利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法，其特征在于，所述步骤S4为：用10毫摩尔高碘酸钠，在0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液中氧化30分钟。将氧化过的单链抗体直接与含有氨基基团的固体在室温共孵育1小时，然后用pH7.4的磷酸缓冲液冲洗，完成单链抗体通过糖链标签定向固定在固体表面。

6.根据权利要求4所述利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法，其特征在于，所述步骤S3为：收集菌体，用低渗的方法制备质周腔可溶蛋白，用Ni柱纯化His-Tag的单链抗体。