[发明专利]20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种三萜类化合物的提取分离方法，具体涉及20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法。

背景技术

肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。刘星堦研究发现人参二醇型皂苷元和人参二醇葡萄糖苷(尤其是人参皂苷Rh₂)具有高度细胞毒活性（达玛烷型三萜研究的进展，国外医学·药学分册，1987，3，141-144）。

研究发现20(s)-原人参二醇-3-酮是俄罗斯学者Morita M. 和 Atopkina， L. N.等将桦叶烯三醇转化为人参皂苷Rh₂及其它人参皂苷化学合成研究中的关键中间产物（王红燕等，人参化学成分研究的新进展，中国药物化学杂志，1992，2(1)：64-70）。因此通过20(s)-原人参二醇-3-酮合成的化学产物能开发成为抗肿瘤药物的药效物质成分。

目前通常采用合成方法制备20(s)-原人参二醇-3-酮，工艺复杂。周媛媛等首次从青龙衣中分离得到20(s)-原人参二醇-3-酮（周媛媛等，中草药，2010，41(1)：11-14），但分离过程复杂，尤其是反复硅胶柱层析过程，需要技术人员的经验判断，不断调整实验参数，不适合工业化生产，且产率较低。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种步骤明确、且产率较高的20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法，包括以下步骤：

（1）提取：取干燥的青龙衣药材，乙醇提取，提取液浓缩得乙醇浸膏；乙醇的浓度为90%～100%，优选95%；

（2）萃取分离：将步骤（1）中制备的乙醇浸膏加水制备悬浮液，依次采用二氯甲烷萃和乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液浓缩得乙酸乙酯浸膏；

（3）硅胶柱层析：取步骤（2）中制备的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，依次采用体积比为15:1～10:1（优选体积比为15:1）的石油醚和乙酸乙酯混合液、体积比为8:1～5:1的石油醚和乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，收集体积比为8:1～5: 1（优选体积比为5:1）的石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液；石油醚的沸程为60～90℃；

（4）二次硅胶柱层析：将步骤（3）中收集的洗脱液进行硅胶柱层析，采用二氯甲烷和甲醇的混合液进行等度洗脱或梯度洗脱；采用等度洗脱时，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为8:1，收集2.5个柱体积后的洗脱液；采用梯度洗脱时（优选洗脱方式），依次采用的体积比为12:1的二氯甲烷和甲醇混合液、体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇混合洗脱液；

（5）反相柱层析：取步骤（4）中收集的洗脱液，进行C18反相柱层析，依次采用30%甲醇和60%的甲醇进行梯度洗脱；收集60%甲醇洗脱液，回收溶剂，即得20(s)-原人参二醇-3-酮。

将20(s)-原人参二醇-3-酮进行甲醇重结晶即得纯度更高的产品。

其中，步骤（1）中乙醇的用量为每克药材采用6～10ml（优选8ml），优选提取方式采用超声提取0.5～1.5h，最佳提取时间50min，反复提取一次，合并提取液。

步骤（2）中混悬液制备时加入蒸馏水的重量为乙醇浸膏的5倍，采用占所述蒸馏水体积的0.75～1倍量（优选等体积量）的二氯甲烷和乙酸乙酯依次进行两相回流萃取1h。

步骤（3）和步骤（4）中硅胶柱层析均采用干法上样，拌样硅胶采用80～100目硅胶，装柱硅胶采用200～300目硅胶。其中，步骤（3）中乙酸乙酯浸膏与拌样硅胶的重量比为1:1.5，乙酸乙酯浸膏与装柱硅胶的重量比为1:20；步骤（4）中进行柱层析前，先将步骤（3）中收集的洗脱液浓缩至浸膏，浸膏进行干法上样，浸膏与拌样硅胶的重量比为1:1，浸膏与装柱硅胶的重量比为1:30。

步骤（5）中C18反相柱采用预先处理好的体积为2cm×100cm的常压敞口玻璃层析色谱柱（C-18反相填料为YMC公司生产，填料粒径≥50μm），洗脱液流速为1ml/min。