[发明专利]一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法。

背景技术

活细胞成像技术可以在一段时间内实时观察细胞内部结构和细胞生理过程的动态变化，而小动物活体成像系统则可以实时监控细胞在活生物体内的活动和基因行为，这两项技术对生物学研究具有至关重要的作用。

采用理想的荧光探针来标记感兴趣的分子或细胞是活细胞成像技术和小动物活体成像系统顺利运行的必要前提。常用的荧光探针有荧光蛋白、小分子有机荧光染料和量子点等。荧光蛋白分子比较大，对于一些研究来说并不合适；小分子荧光染料和量子点无机纳米晶颗粒（小于10nm）对于兴趣分子自然行为的影响更小。其中量子点荧光探针具有光稳定性好，荧光强度高，可以长时间实时监控等多种优点^【1-3】。量子点探针在荧光成像应用中多与抗体、蛋白质或者糖类偶联使用；用于标记细胞时由于透膜性差，不能直接标记细胞。

现阶段用于标记活细胞的量子点探针通常与穿膜肽（具有细胞膜穿透能力的小分子多肽）偶联后，借助穿膜肽的作用被导入细胞。例如Invitrogen公司的Qtracker? Cell Labeling Kits系列探针。穿膜肽修饰的量子点探针不仅制作成本高，而且由于穿膜肽的原因，量子点探针进入细胞后以囊泡的形式分散在胞浆中。这些囊泡的存在对目的细胞自然行为的影响远大于荧光蛋白，也使量子点直径小、对兴趣分子影响小等优点不复存在。所以，对量子点探针的修饰方法仍有待改进。

发明内容

针对上述缺点，本发明公开了一种甘氨酸修饰的量子点荧光探针标记活细胞的方法。成功标记后，量子点-甘氨酸探针主要分布在胞浆中的线粒体和内质网上，发光分散均匀，可用于在激光共聚焦显微镜下或小动物活体成像系统中示踪活细胞。

本发明采用的技术方案是，一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法，包括如下步骤：

1）甘氨酸与量子点偶联制备探针

将羧基水溶性量子点和甘氨酸分散在50mM硼酸盐缓冲液中（pH8.4，含0.05% NaN₃），加入N-（3-二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC），使水溶性量子点和甘氨酸在EDAC作用下进行偶联，得到量子点-甘氨酸偶合物；截留分子量为50kDa的超滤管纯化浓缩量子点-甘氨酸偶合物，即得量子点-甘氨酸探针。水溶性量子点包括羧基官能团水溶性量子点和氨基官能团水溶性量子点，进行偶联时，所述羧基官能团水溶性量子点的羧基与甘氨酸的氨基进行偶联，或氨基官能团水溶性量子点的氨基与甘氨酸的羧基进行偶联。

鉴定量子点-甘氨酸探针，纯化的量子点-甘氨酸偶合物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图1所示。从上往下为负极到正极，电压为100V，60min，302nm 紫外激发，537nm±35nm 滤光片成像；从左到右分别为1: 羧基官能团水溶性量子点、2: 量子点-甘氨酸探针。

2）细胞培养

采用胰酶组织消化法制取乳鼠组织细胞悬液，将乳鼠组织细胞悬液接种至细胞培养板或细胞培养瓶，置入细胞培养箱培养2～3d。

3）量子点-甘氨酸探针标记细胞

弃去步骤2）中的细胞培养板或细胞培养瓶中的培养基，用磷酸盐缓冲液轻柔漂洗2～3次后，加入含有0.5 μM量子点-甘氨酸探针或0.5 μM水溶性量子点的磷酸盐缓冲液，37℃孵育30min后去除含有0.5 μM量子点-甘氨酸探针或0.5 μM水溶性量子点的磷酸盐缓冲液，用磷酸盐缓冲液轻柔漂洗2～3次，更换为普通细胞培养基，完成活细胞标记。

4）激光共聚焦显微镜观察

根据水溶性量子点的类型选择相应的激发波长，将步骤3）中标记好的活细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。

采用本发明方案达到的有益技术效果如下：

1、制备量子点-甘氨酸探针，只需要一步反应即可实现，反应时间短，实验条件要求不高，制备探针时可以快速实现，且成本低廉。

2、量子点的羧基和甘氨酸的氨基通过化合反应高稳定性结合，制备的量子点-甘氨酸探针非常稳定，可以长期保存。

3、探针使用方法简单方便，孵育时间短。

4、甘氨酸是必须氨基酸的一种，对细胞没有毒性，甘氨酸标记的量子点探针在使用中也未发现明显的细胞毒性。

5、标记后，量子点-甘氨酸探针主要分布在胞浆中的线粒体和内质网上，发光分散均匀，可用于在激光共聚焦显微镜下或小动物活体成像系统中示踪活细胞。

附图说明