[发明专利]一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法

权利要求书

1.一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法，其特征是：采用灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、液体摇瓶培养后，利用复合酶液水解灵芝菌丝体，在28~32℃下振荡1.5~4h，制备原生质体，采用亚硝酸作为诱变剂，诱变灵芝原生质体，选择生长速度快、菌丝雪白的再生菌落经花生粕斜面培养基、花生粕液体发酵培养基培养，获得生物量和多糖、三萜类化合物；

具体步骤如下：

（1）配制马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基：按照GB4789.15—2010《食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数》配制，用于菌种的复苏及保存；

（2）菌种活化：取灵芝No. 5.786菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化1~2次；

（3）取液体培养的菌丝，过滤收集菌丝球，用无菌水冲洗2~3次，再用甘露醇冲洗2~3次，转入巯基乙醇中，恒温摇床振荡30~60min，过滤收集菌丝球，用甘露醇冲洗2~3次，离心分离取沉淀为菌丝体，取菌丝体以1:10~20的比例加入复合酶液，恒温下振荡酶解2~4h，过滤后滤液于500~1000r/min离心3~5min，取上清液于3000~4000 r/min，离心5~10 min，沉淀即为原生质体，用甘露醇冲洗并用0.9％生理盐水把原生质体稀释10~15倍；

（4）向原生质体稀释液中加入等量的0.06mol/LNaNO₂和1mol/L醋酸缓冲液，27℃恒处理5~25min，再加入两倍于醋酸缓冲液体积的0.7mol/L pH 8.6的Na₂HPO₄溶液终止诱变；将诱变后的原生质体分别涂在再生培养基上，27℃培养5天；

（5）将生长速度快、菌丝雪白的菌落接种在花生粕斜面培养基上，该培养基组成为玉米10~30g/L，花生粕2~5g/L，KH₂PO₄ 1~3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5~1.5 g/L，VB₂ 0.3~0.8g/L，琼脂20g/L。

2.27℃培养6~7天得第一代诱变菌株，将其接种新的花生粕斜面培养基上；27℃培养6~7天得第二代诱变菌株，按同样方法获得第三代~第九代菌株；

（6）接种第一、三、五、七、九代菌块于花生粕液体发酵培养基中，该培养基组成为玉米10~30 g/L，花生粕2~5 g/L，蛋白胨1~3 g/L，葡萄糖10~30 g/L，酵母膏1~3 g/L，KH₂PO₄ 1~3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5~1.5 g/L，pH 6.5，27℃摇床培养5~7天；

（7）分离生物量：发酵液过滤收集菌丝，60℃烘干至质量恒定并称质量；

（8）胞内粗多糖的提取：取干菌丝体1g，加入10倍体积蒸馏水，90℃水浴2~3h，4000 r/min离心5~10min，收集上清液，沉淀再重复浸提2次，合并3次的上清液，80~90 ℃水浴浓缩成原体积的0.2~0.25倍，加入4~5倍体积95%乙醇，4℃静置，浓缩液离心，用无水乙醇洗涤沉淀两次，烘干至恒重，得胞内粗多糖；

（9）胞内三萜类化合物的提取：取干菌丝体1g加50 mL甲醇静置过夜后过滤，蒸干后加4 mL 95%乙醇溶解；

（10）诱变菌株放置石蜡油或砂土管中，4℃保存，每一年传代一次。