[发明专利]一种壳聚糖修饰提高胆固醇氧化酶稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖修饰提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

胆固醇氧化酶(COD)是胆固醇代谢过程中关键酶，能专一性催化胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮，它作为一种胆固醇检测酶应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、抗虫基因工程、生物农药等方面也具有广泛应用价值。

由于胆固醇氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其稳定性是该酶大量应用的基础。目前，提高酶稳定性方法主要有，蛋白质工程、固定化、添加保护剂、化学修饰等，其中固定化是较为常用的方法。本发明中使用碳二亚胺法及戊二醛法修饰胆固醇氧化酶，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是一种将氨基和羧基偶联的缩合剂，载体或蛋白羧基被碳二亚胺活化，生成中间产物，该产物再与蛋白氨基反应形成结合物；戊二醛作为双功能试剂，广泛应用于酶固定化中。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，本发明设计巧妙、条件温和、易操作、成本低、环境污染小、适于大规模应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案：一种壳聚糖修饰提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，A、采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联或B、采用戊二醛交联，步骤为：

利用壳聚糖20000作为修饰工具，将壳聚糖的活性氨基与胆固醇氧化酶的活性氨基或羧酸基交联；反应时间为16-20小时，所述反应温度为4-10℃。

为了实现上述目的，在交联之前需要研究胆固醇氧化酶分子表面羧酸基及氨基数目，所述单个胆固醇氧化酶分子表面羧酸基数目为45个，氨基数目为60个。

较佳地，当采取EDC交联法时，所述酶分子游离羧酸基与壳聚糖氨基摩尔比1:10，游离羧基与EDC摩尔比为1:2，所述反应pH为6.0。

较佳地，所述反应时间为16-20小时，所述反应温度为4-10℃。

较佳地，所述反应后使用Sepharose 4B介质进行分子筛层析去除为反应物质。

较佳地，当采取戊二醛交联法时，所述酶分子游离氨基与壳聚糖氨基摩尔比1:2，酶游离氨基与戊二醛摩尔比为1:2，所述反应pH为8.0。

较佳地，所述反应时间为16-20小时，所述反应温度为4-10℃。

较佳地，所述反应后使用Sepharose 4B介质进行分子筛层析去除为反应物质。

所述固定化酶的热、pH和存储稳定性均优于游离酶。

本发明的有益效果：

1、本发明在固定前，分析了胆固醇氧化酶分子表面酸性与碱性氨基酸分布情况，便于其后进行修饰；

2、本发明以壳聚糖20000为修饰物，通过化学合成法将其与胆固醇氧化酶连接；

3、本发明优化了胆固醇氧化酶修饰条件，增强了操作的精确性。

附图说明

图1是胆固醇氧化酶分子表面羧酸基分布图。

图2是胆固醇氧化酶分子表面氨基分布图。

图3是不同pH对修饰COD活力的影响。

图4是游离羧基与EDC摩尔比及COD氨基与戊二醛摩尔比对修饰COD活力的影响。

图5是原始酶和修饰酶的热稳定性。

图6是原始酶和修饰酶的pH稳定性。

图7是原始酶和修饰酶的存储稳定性。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

实施例1  胆固醇氧化酶羧酸基与壳聚糖氨基摩尔比对修饰COD活力的影响：

取20-30g/L壳聚糖20000 溶液于15 mL的离心管中，按照不同胆固醇氧化酶羧基与壳聚糖氨基摩尔比 (1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:120) 加入EDC和胆固醇氧化酶的量，加入磷酸缓冲液至总体积为10mL，调节溶液pH至6.0，4-10℃、50 r/min振荡固定16-20小时。反应液上Sepharose 4B层析柱进行分子筛层析，获得经过修饰后分子量上升的组分，测定酶活力，计算相对酶活力(%)。

相对酶活力（%）=[修饰酶活力/（初始酶活力－未偶联酶活力）]×100%

将不同修饰的酶置于37℃水浴锅内，24小时后测定酶活力，计算酶活力保留率(%)。

酶活保留率（%）=（24小时后修饰酶活力/初始修饰酶活力）×100%

摩尔比过高，酶分子紧密堆积抑制底物与酶活性部位反应，造成酶活力下降，所以，摩尔比1:10对稳定性作用最佳，结果见表2。