[发明专利]猪附红细胞体分离纯化的方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过物理方法使附红细胞体从红细胞上分离纯化出来的方法。

 

背景技术

附红细胞体病(Eperythrozoonsis)是由附红细胞体(Eperythmzoon，EH)寄生于人、动物红细胞表面、血浆及骨髓内，引起的一种以贫血、黄疸、发热等为主要临床症状的人畜共患病。

目前对该病的生物学研究中对附红细胞体的分离纯化大多采用化学试剂或药物解离法，但化学试剂解离法后附红细胞体的活动性大大减弱，且提纯的附红细胞体个体量也较少，药物解离法则因为药物剂量的不同对红细胞产生不同的影响，甚至引起红细胞溶血，致使抗原纯度降低，从而影响试验结果。

 

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述缺陷，本发明的目的在于，提供一种猪附红细胞体分离纯化的方法，解决现有技术采用化学试剂法附红细胞体的活动性大大减弱，且提纯的附红细胞体个体量也较少，药物解离法则因为药物剂量的不同对红细胞产生不同的影响，甚至引起红细胞溶血，致使抗原纯度降低，从而影响试验结果的问题。

本发明提供的猪附红细胞体分离纯化的方法，包括以下步骤：

一、病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样1ml,4℃或冷冻保存，于采集的临床血样中加入3倍0.01mol/L、pH为7.4的PBS清洗，2000r/min离心10min，去上清液，于沉淀中加入1倍的PBS稀释，56℃水浴3min，立即2000r/min离心10min，弃沉淀，取上清于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4℃或－20℃保存备用；

二、对经56℃水浴分离的富含附红细胞体的沉淀中按1:2比例加入灭菌蒸馏水，置于37℃溶血10min；

三、将灭菌的蔗糖用PBS缓冲液配制成2个梯度，在离心管中从下到上依次加入55%和20%的蔗糖溶液，将经过超离的粗提液3ml小心加入在20%的蔗糖液上面，4℃12000r/min离心2h，最后用灭菌注射器小心吸取55%和20%的蔗糖段之间的附红细胞体带；

四、在收集的提纯物中加入PBS缓冲液，4℃10000r/min离心2h去蔗糖，弃上清，沉淀用2ml的PBS缓冲液悬浮，分装后-20℃保存备用。

本发明提供的猪附红细胞体分离纯化的方法，其有益效果在于，本发明在无菌采集到血样后，首先用PBS缓冲液进行了冲洗，初步分离纯化了血样，排除了干扰物质，为后续的分离纯化奠定基础；采用了56℃水浴加热使附红细胞体脱离于红细胞的物理学方法，既不影响附红细胞体的活性，同时也可以多次分离，从而可以获得更多的抗原量；在附红细胞体脱离红细胞后，又采用了蔗糖层析的方法进一步纯化附红细胞体，使获得的抗原的纯度增加。

 

具体实施方式

下面结合一个实施例，对本发明提供的猪附红细胞体分离纯化的方法进行详细的说明。

 

实施例

本实施例的猪附红细胞体分离纯化的方法，包括以下步骤：

一、            病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样1ml,4℃或冷冻保存，于采集的临床血样中加入3倍0.01mol/L、pH为7.4的PBS清洗，2000r/min离心10min，去上清液，于沉淀中加入1倍的PBS稀释，56℃水浴3min，立即2000r/min离心10min，弃沉淀，取上清于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4℃或－20℃保存备用；

二、            对经56℃水浴分离的富含附红细胞体的沉淀中按1:2比例加入灭菌蒸馏水，置于37℃溶血10min；

三、            将灭菌的蔗糖用PBS缓冲液配制成2个梯度，在离心管中从下到上依次加入55%和20%的蔗糖溶液，将经过超离的粗提液3ml小心加入在20%的蔗糖液上面，4℃12000r/min离心2h，最后用灭菌注射器小心吸取55%和20%的蔗糖段之间的附红细胞体带；

四、            在收集的提纯物中加入PBS缓冲液，4℃10000r/min离心2h去蔗糖，弃上清，沉淀用2ml的PBS缓冲液悬浮，分装后-20℃保存备用。