[发明专利]脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法，其特征在于，该方法从羊脑多头蚴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸；将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-HSP，经转化大肠杆菌BL21（DE3）后IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法。

2.如权利要求1所述的脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法，其特征在于，培养基和常用溶液的配制方法为：

利用超纯水配制溶液，用0.22μm的过滤器过滤配制好的IPTG溶液；

将超纯水800 mL 混合Yeast Extract5 g，Trypton、10 gNaCl10g，调节pH值至7.2，定容至1 000 mL，并于121℃高压蒸汽灭菌20 min，再置于4℃保存；

将琼脂粉加入液体LB培养基，于121℃的高压灭菌锅灭菌20min，最后将琼脂粉的浓度调节为1.5%(w/v)；最后在琼脂糖培养基温度降低后加入氨苄青霉素并倒板；

利用购买的氨苄青霉素和超纯水配制成工作液浓度100mg/mL，再用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存备用；

将27.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5 mol/L EDTA溶液，最后加超纯水定容至1 000 mL；

将1g琼脂糖粉末置于90mL超纯水，再加入10mL的5×TBE，定容至100mL；

0.8gN,N'一亚甲叉双丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于适量超纯水中，定容至100mL，于4℃避光保存；

将18.17gTris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为8.8，最后定容至100mL，并于4℃保存；

将12.11g Tris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为6.8，最后定容至100mL，并于4℃保存；

将10gSDS干粉溶于80mL的灭菌超纯水中，同过加热溶解干粉，最后定容至100mL；

将1g过硫酸铵溶于水中，定容至10mL；

1.6 mL双蒸水、2 mL30%丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris(pH8.8)1.3 mL、0%过硫酸铵0.05 mL、TEMED 0.002 mL、 10%SDS 0.05 mL；

10%SDS0.01 mL、 0.68 mL双蒸水、1.0 mo1/L Tris(pH6.8)0.13 mL、30%丙烯酞胺0.17 mL、 10%过硫酸铵0.01 mL、TEMED 0.001 mL；

取14.4g甘氨酸、3gTris混合1gSDS溶解于超纯水，最后定容至1000mL；

缓冲液：将0.1%溴酚蓝、25%甘油、14.4mmol/L 2-巯基乙醇、2%SDS混合于60mmol/LTris-HCl；

将45mL甲醇，45mL水，10mL冰乙酸，0.25g考马斯亮蓝R-250；

90mL甲醇:水（1:1），10mL冰乙酸；

将Tris碱5.8g，甘氨酸2.9g，SDS（电泳级）0.37g，甲醇200mL，加去超纯水定容至1000mL；

KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·H₂O2.9g、0.2gKCl 、8.8gNaCl、用超纯水定容至1000mL，并置于高压灭菌锅灭菌后4℃保存备用；

将NaCl8.8g、 1MTris-HCl（pH8.0）20mL、加入800mL超纯水充分搅拌溶解，再加Tween-200.5mL混匀，最后加超纯水定容至1000mL，并用高压灭菌锅灭菌后于4℃保存备用；

PBS10mL， BSA0.1g，现配先用；

6.0mgDAB，10mL0.01M PBS，1μL H₂O₂；

NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na₂HPO₄.12 H₂O 3.58 g，KH₂PO₄ 0.27 g加去离子水溶解并定容至1 000mL；

在上述PBS中按0.05%加入Tween-20，混匀；

含5%FBS的0.01 mol/L pH7.4 PBS溶液；

临用前配制0.1 mol/L 柠檬酸（2.1 g/100 mL），0.2 mol/L Na₂HPO₄. 12H₂O 6.1 mL，ddH₂O 12.5 mL， 邻苯二胺 10 mg， 溶解后，加入30%H₂O₂ 40 μL；

终止液采用2 mol/L H₂SO₄ 。