[发明专利]一种生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法及其专用培养基

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法及其专用培养基。

背景技术

紫杉醇（1）作为临床一线抗癌用药，目前被广泛用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种实体癌的治疗。目前规模化生产紫杉醇的途径主要是从红豆杉属植物中直接提取或提取其半合成前体——10-去乙酰巴卡亭III（2），再通

过合成手段合成紫杉醇。最近，以7-木糖-10-去乙酰紫杉醇（3）作为原料，合成紫杉醇的工艺被陆续开发出来（US5412116，US6028206，US5856532，US6437154，ZL200610046296.6和ZL200610047743.X）。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇与紫杉醇同属三环二萜类化合物，在南方、云南和中华红豆杉枝叶中广泛存在，该化合物与紫杉醇的差别仅在于C-7位多一个木糖基，C-10位缺少一个乙酰基，因此如果通过有效方法去除C-7木糖基，并在C-10引入乙酰基，就可以将其转化为紫杉醇，从而达到对我国红豆杉资源的有效利用。因此该工艺将是未来紫杉醇产业中不可缺少的工艺之一。但由于可再生资源中其他有用紫杉烷含量较低，因此整体利用价值不高，导致7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的来源成为制约该工艺的主要因素。

利用植物细胞培养方法生产紫杉醇因其生产周期短、可控性强、不破坏资源等优点日益受到重视。但传统工艺更多关注的是紫杉醇含量的高低，由于紫杉醇毒性高，水溶性差的特点，导致产率达到一个极限值后很难再有所突破。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇是紫杉醇代谢路径上的一个中间化合物，其水溶性是紫杉醇10倍以上，而毒性是紫杉醇的1/10，在理论上，应该是一个更容易在细胞中累积的化合物。因此利用植物细胞培养的方法获得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇应该是一个有效的方法，但遗憾的是之前并无这方面的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法及其专用培养基。

本发明提供了一种基本培养基，该培养基的配方为：NH₄NO₃ 1100-1300mg，KNO₃ 1800-2000mg，KH₂PO₄ 320-360mg，CaCl₂·2H₂O 420-460mg，MgSO₄·7H₂O 350-380mg，FeSO₄·7H₂O 26-29mg，Na₂-EDTA 36-38mg，MnSO₄·4H₂O 2.0-2.5mg，H₃BO₃ 0.5-0.7mg，KI 0.7-0.9mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.02-0.03mg，CuSO₄·5H₂O 0.002-0.003mg，CoCl₂·6H₂O 0.002-0.003mg,Zn·Na-EDTA 12-17mg，盐酸硫胺素0.4-0.6mg，烟酸0.4-0.6mg，盐酸吡哆醇0.4-0.6mg，甘氨酸1-3mg，用水定容至1L，pH5.6-5.8。

本发明还提供了利用所述培养基生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，该方法步骤如下：

1）无菌条件下，将红豆杉的外植体在体积百分浓度70%的乙醇中消毒30s，再将其置于质量百分浓度为10%的次氯酸钠中杀菌20min，用无菌水冲洗3次，接种前将外植体切成长度为5mm的小段，将其接种于愈伤组织诱导培养基中在24℃，黑暗条件下诱导愈伤组织；

2）将愈伤组织接种于继代培养基中在24℃，黑暗条件下进行继代培养。

本发明提供的生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，所述愈伤组织诱导培养基为在权利要求1所述的基本培养基的基础上添加2,4-D 1-7mg，蔗糖20-50g，琼脂5-8g/L。

本发明提供的生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，所述继代培养基为在权利要求1所述的基本培养基的基础上添加2,4-D 1-5mg，蔗糖20-50g，琼脂5-8g/L。

本发明提供的生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，所述红豆杉为南方红豆杉、云南红豆杉或中华红豆杉。