[发明专利]基因转染实时监测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基因转染实时监测的方法。

背景技术

随着人类基因组计划的完成和细胞生物学技术的进步，基因治疗将在人类攻克肿瘤这一顽症过程中占据重要地位，并将成为一种常见的治疗手段。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定的方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的的生物医学新技术。基因转染技术已广泛应用于基因治疗研究中。基因转染是指将具有生物功能的核酸分子（基因）转移或运送到细胞内并使核酸分子（基因）在细胞内维持其生物功能。将转染基因导入细胞进行表达是实现基因治疗的必须步骤。而监测转染基因在进入细胞后在细胞内的亚细胞分布及最终的细胞内定位则有利于研究外源基因进入细胞引起的生物学现象，进而揭示转染基因的特定生物学机制。

近年来，可视化追踪转染基因在细胞内的定位及分布，引起了越来越多的科学工作者的关注。如Mingyuan Gao等基于量子点构建了一种新型的基因载体，利用量子点优良的光学性质，实现了基因转染的同时，对转染过程进行实时，可视化示踪。

然而传统的用于可视化示踪外源的转染基因在细胞内的分布及定位，主要侧重于应用具有光学特点的纳米材料进行标记，过程复杂、成本相对较高。

发明内容

基于此，有必要提供一种快速简易的基因转染实时监测的方法。

一种基因转染实时监测的方法，包括如下步骤：

将四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺与含有荧光蛋白表达基因的待转染质粒DNA按照质量比为1:1~4:1的比例在水中混合均匀，室温下反应，得到负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液；

向激光共聚焦成像培养皿中接种1.2~2*10⁴个待转染细胞，在二氧化碳培养箱中于37℃孵育18~24小时，所述培养液的培养基含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗；

更换使用不含胎牛血清且不含双抗的培养基并加入所述负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液，控制所述聚乙烯亚胺的终浓度为1~10μg/mL，继续孵育4~6小时后换用含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗的培养基继续孵育18~48小时；及

用pH 7.4的磷酸缓冲液冲洗上述培养的待转染细胞，加入新鲜的含10%质量分数的胎牛血清且不含双抗的培养基进行实时激光共聚焦扫描监测。

在其中一个实施例中，所述四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺通过如下步骤制备：

配置浓度为10~20mM的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液及浓度为5~20mM的四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液；

按照聚乙烯亚胺与四甲基异硫氰酸罗丹明的摩尔比为1:1~1:40的比例将所述聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液与所述四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲基亚砜溶液混合搅拌5~8小时，之后将得到的混合液置于截留分子量为2000~3500的透析袋中，先用二甲基亚砜透析3~5次，共透析1~2天，再用超纯水透析2~3天，得到所述四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺。

在其中一个实施例中，所述荧光蛋白表达基因为绿色荧光蛋白表达基因。

在其中一个实施例中，所述待转染细胞为人胚肾细胞。

上述基因转染实时监测的方法基于四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺，可在室温下对聚乙烯亚胺进行四甲基异硫氰酸罗丹明标记，合成简单、条件温和、成本低、便于操作，是一种普适通用的方法。通过标记了四甲基异硫氰酸罗丹明的聚乙烯亚胺静电吸附表达荧光蛋白的质粒DNA，并将质粒DNA转染到细胞内，采用荧光成像的方法实时监测作为载体的聚乙烯亚胺和质粒在细胞内的分布及质粒在细胞内的表达，该方法简单易于实现，适用于绝大多数实验室，便于操作推广。

附图说明

图1为一实施方式的基因转染实时监测的方法流程图；

图2为实施例4的激光共聚焦扫描成像结果图；

图3为实施例5的激光共聚焦扫描成像结果图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对基因转染实时监测方法作进一步详细的说明。

如图1所示，一实施方式的基因转染实时监测的方法，包括如下步骤：

步骤S110，将四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺与含有荧光蛋白表达基因的待转染质粒DNA按照质量比为1:1~4:1的比例在水中混合均匀，室温下反应，得到负载质粒DNA的聚乙烯亚胺的水溶液。其中该聚乙烯亚胺标记有四甲基异硫氰酸罗丹明。。

其中，四甲基异硫氰酸罗丹明标记的聚乙烯亚胺可以通过如下步骤制备：