[发明专利]封闭系统多阶段核酸扩增反应

权利要求书

1.控制嵌套扩增反应的方法，所述方法包括如下步骤：

a)在流体封闭系统的反应室中，进行第一阶段扩增反应，包括使用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中扩增来自样品的一种或多种靶多核苷酸，以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一种靶多核苷酸的初始引物，其中存在有荧光指示剂的情况下扩增所述一种或多种第一扩增子，所述荧光指示剂能够产生与所述第一阶段扩增反应中的扩增子的数量相关的光信号；

b)监测所述第一阶段扩增反应中的荧光指示剂的光信号；

c)当所述光信号达到或超过阈水平时，在所述反应室中自动保留有效部分的所述第一阶段扩增反应的反应混合物；以及

d)在所述反应室中，使用第二阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增所述有效部分中的一种或多种第一扩增子，以形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子中的每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的初始引物均嵌套在所述第一扩增子中。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一阶段扩增反应的所述反应混合物处于流体封闭反应系统的反应室中，并且其中所述步骤c)还包括，除了保留在所述反应室中的所述有效部分外，以流体形式将所述第一阶段反应混合物转移至废料容器。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述反应室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得当所述第一阶段反应混合物以流体形式通过所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述第一阶段反应混合物被保留在所述反应室中的出口之下。

4.如权利要求3所述的方法，其中保留在所述反应室中的所述体积包括所述有效部分。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少1分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述一种或多种第一扩增子的一定体积的所述反应混合物。

7.如权利要求2所述的方法，其中所述反应混合物具有一定体积，并且其中所述有效部分是所述反应混合物的体积百分比，所述百分比选自0.5%至10%的范围。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述阈水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1.5至25的范围。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述阈水平对应由所述光信号确定的增长曲线的最大、最小或零值。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光指示剂是特异结合双链DNA的插入染料或者包含特异结合扩增产物的寡核苷酸部分。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一扩增子通过在所述第一阶段扩增反应中扩增参照序列而产生。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一扩增子通过在所述第一阶段扩增反应中扩增靶多核苷酸而产生。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述流体封闭反应系统包括：

反应室，其与含有样品的样品容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通，每一所述容器均为流体封闭的。