[发明专利]艰难梭菌外毒素A羧基端序列密码子优化基因片段、表达载体构建方法及其表达蛋白的应用有效
申请号: | 201210568057.2 | 申请日: | 2012-12-16 |
公开(公告)号: | CN103865938A | 公开(公告)日: | 2014-06-18 |
发明(设计)人: | 刘红;冯东晓;邢平平;徐从伦;李敏;郭桂平;于锦丽;赵志伟 | 申请(专利权)人: | 山东国际生物科技园发展有限公司 |
主分类号: | C12N15/31 | 分类号: | C12N15/31;C12N15/70;C12N15/66;C07K16/12;A61K39/08;A61P31/04 |
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地址: | 264670 山*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 艰难 梭菌外 毒素 羧基 序列 密码子 优化 基因 片段 表达 载体 构建 方法 及其 蛋白 应用 | ||
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及密码子改造的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段、表达载体构建方法及其在大肠杆菌中的高效表达方法。
背景技术
艰难梭菌是一种革兰氏阳性、产芽孢、专性厌氧的梭状杆菌,是目前医院内感染的主要致病因素。艰难梭菌的感染是接触性传播,可通过口-粪途径定植在结肠,并可通过与患者、被污染设备或物品(例如便盆、澡盆和电子直肠温度计)直接接触,医护人员间接接触,经过几天到8周的潜伏期,引起医院内艰难梭菌感染暴发。艰难梭菌治疗的难点在于作为休眠形式的芽孢可以耐受多种消毒剂,使其可以在医院环境中长期存在,因而一旦医院发生艰难梭菌感染暴发,难以在短时间内根除。
艰难梭菌毒性主要源于其表达的两种外毒素,毒素A和毒素B。这两种毒素都属于糖基转移酶类,可以使Rho蛋白家族的GTP酶失活。毒素A既是一种肠毒素又是一种细胞毒素,是艰难梭菌的主要毒力因子。研究表明,毒素A通过其羧基端与靶细胞表面受体结合来发挥毒性作用。已有研究证明抗艰难梭菌毒素A羧基端的抗体可以有效的中和其肠毒性和细胞毒性,从而对艰难梭菌的治疗起到积极作用。所以,艰难梭菌外毒素A羧基端是抗体开发的理想靶标,而通过合适的方法获得外毒素A羧基端片段是制备及检测其抗体的基础。
CN 101870978A中公开了一种即可在大肠杆菌中表达又可在哺乳动物中表达的密码子优化后的艰难梭菌毒素A羧基端序列,由于其兼顾性,存在原核表达系统与真核表达系统在密码自偏爱性方面的差异,其在大肠杆菌中的表达效率并不是很高。
发明内容
本发明提供一种可在大肠杆菌等原核系统中高效表达的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段,以及表达后的蛋白作为抗原在制备抗艰难梭菌外毒素A抗体和抗艰难梭菌感染疫苗中的应用。
本发明提供一种优化多重复区基因的方法,即以每个独立重复区的保守序列为模块进行多种密码子优化,再将优化后的模块进行组合得到多种重复性低且适于相应表达系统的新基因序列。
本发明还提供一种新的重组载体构建方法,运用多片段连接体系,即目的片段分两段或多段合成,后与载体同时连接的策略构建重组载体。
为实现上述目的,本发明提供了一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列,其是将艰难梭菌外毒素A原始序列重复区中保守氨基酸序列(conservative aa sequence,CAS)的密码子优化为大肠杆菌中使用频率高的兼并性密码子,优化后的基因序列可在大肠杆菌中表达,而氨基酸序列不变。不同保守区的多种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因重复序列的DNA序列(表2),根据同源性分析选取的11个保守氨基酸序列命名为CAS1-11,其中,CAS1密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1-5中的任一种序列,CAS2密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7,CAS3密码子优化后的核苷酸序列选自SE QID NO.8或SEQ ID NO.9,CAS4密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11,CAS5密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13,CAS6密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15,CAS7密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17,CAS8密码子优化后的核苷酸序列选自SEQID NO.18或SEQ ID NO.19,CAS9密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.20-24中的任一种序列,CAS10密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26,CAS11密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28。由这些不同保守区的多种优化的重复序列可相互组合拼接成适合在大肠杆菌中表达的的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。其中随机选取其中的三种优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列分别为:第一种优化组合具有SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列、第二种优化组合具有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列,第三种优化组合具有SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列。本发明设计合成了既符合大肠杆菌密码子偏爱性的毒素A羧基端核苷酸序列,同时通过同义密码子替换改善了原始序列多重复区对化学基因合成的影响,降低了合成成本;并且优化是在保证艰难梭菌外毒素A羧基端氨基酸序列不变的情况下,通过密码子改变对羧基端基因重复序列进行调整,充分考虑大肠杆菌密码子利用偏好进行基因序列优化,所获得的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段可在大肠杆菌原核系统中高效表达。
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